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.2007年6月；3（6）：e89。
doi:10.1371/journal.pgen.0030089。 Epub 2007年4月19日。

KAP1结合的全基因组分析提示KRAB-ZNFs的自身调节

亨丽埃特·奥金 1, 沙龙·L·斯夸佐, 苏什玛·艾扬格, 金·布拉尼克, 约翰·莱恩, 霍华德·Y·张, 罗兰德·格林, 佩吉·法恩哈姆
附属公司

KAP1结合的全基因组分析提示KRAB-ZNFs的自身调节

亨丽埃特·奥金等。 公共科学图书馆-基因. 2007年6月.

摘要

我们对Ntera2睾丸癌细胞组蛋白H3的两种修饰（赖氨酸9的三甲基化[H3me3K9]和赖氨酸27的三甲基化[H3me3K27]）以及三种不同的人体原代成纤维细胞解剖来源进行了基因组染色质免疫沉淀（ChIP）芯片比较。我们发现，在每种细胞类型中，这两种修饰在两大类转录因子的启动子处差异富集。具体来说，锌指（ZNF）基因与H3me3K9结合，同源异型盒基因与H3me3K27结合。我们之前已经表明，多梳抑制复合物2负责介导人类癌细胞中组蛋白H3的赖氨酸27的三甲基化。相反，H3me3K9靶点和Polycomb抑制复合物2的成分之间几乎没有重叠，这表明不同的组蛋白甲基转移酶负责H3me3G9修饰。先前的研究表明，SETDB1可以通过体外或人工系链实验，在赖氨酸9上三甲基化H3。SETDB1被认为是通过含有KAP1辅阻遏物的复合物招募到染色质。为了确定含KAP1的复合物是否介导已确定的H3me3K9靶点的三甲基化，我们进行了ChIP-ChIP分析，并使用人类5-kb启动子阵列鉴定了KAP1靶基因。我们发现，在正常细胞和癌细胞中，大量ZNF转录因子基因同时与KAP1和H3me3K9结合。为了扩大我们对KAP1的研究，我们接下来使用38阵列拼接集对KAP1-结合进行了完整的基因组分析，确定了约7000个KAP1结合位点。确定的KAP1靶点高度富集C2H2 ZNF，尤其是那些含有Krüppel-associated box（KRAB）结构域的靶点。有趣的是，尽管大多数KAP1结合位点位于核心启动子区域内，但ZNF基因附近的结合位点在目标基因的转录区域内显著富集。由于KAP1是通过与KRAB-ZNF蛋白的相互作用被招募到DNA中的，我们认为KRAB-Z NF基因的表达可能是通过涉及KAP1的自身调节机制来控制的。

PubMed免责声明

利益冲突声明

相互竞争的利益。本研究中使用了NimbleGen系统微阵列。作者之一RG是该公司的一名员工。此外，PJF和RG是NIH拨款的联合PI，部分资助了这项工作。

数字

图1
图1。H3me3K9和H3me3K27靶向不同类别的转录因子
（A） 绘制了H3me3K27（x轴）和H3me3K9（y轴）的Ntera2 ChIP-ChIP数据的5-kb启动子阵列集合的Maxfour值（见材料和方法）。（B） 使用DAVID程序在Ntera2细胞（黑条）、足成纤维细胞（白条）、肺成纤维细胞和包皮成纤维细胞中确定了与H3me3K9或H3me3G27结合的前2000个基因的功能类别。H3me3K9和H3me3K27的“转录”类别显著丰富（见表1和表S2）。第页-显示了锌指和同源异型盒这两类主要转录因子的富集意义值。
图2
图2。H3me3K9与ZNF基因簇结合，H3me3G27与同源框基因簇结合
在ZNF基因簇（19号染色体1.6 Mb，顶面）和HoxC簇（12号染色体0.15 Mb，底面）比较Ntera2细胞中H3me3K9和H3me3G27（来自5-kb启动子阵列ChIP-ChIP数据）的结合模式。
图3
图3。利用ENCODE拼接阵列识别KAP1结合位点
（A） 使用针对不同KAP1表位的两种抗体（兔多克隆，r-KAP1和鼠单克隆，m-KAP1）在Ntera2细胞中进行ChIP-ChIP分析。使用Tamalpais峰值调用程序确定了两个KAP1结合位点（一个位于Enm005，顶面板，另一个位于Enr132，底面板）[37]。（B） 使用第三个生物复制的扩增子，使用兔KAP1抗体，对ENm005和ENr132区域中两个确定的KAP1结合位点进行PCR分析。与总染色质DNA相比，KAP1和H3me3K9富集。将IgG扩增子作为阴性对照进行分析。
图4
图4。KAP1和H3me3K9与Ntera2细胞中的一组常见启动子结合
显示也被H3me3K9或H3me3K27结合的（A）SUZ12靶启动子和（B）KAP1靶启动子的百分比的图表。对于每个因子，使用来自两个生物复制ChIP-ChIP分析的前2000个目标启动子（5-kb阵列集）。这导致H3me3K9或H3me3K27共占的基因集具有高置信度，因为目标基因必须存在于所分析的所有四个阵列中。
图5
图5。KAP1结合的KRAB-ZNF基因在低水平表达
方框图显示了最高表达RNA（阵列上所有RNA的前20%）和不同目标基因类别的第25、50和75个四分位表达水平：所有KAP1靶基因、所有H3me3K9靶基因、KAP1和H3me3G9共占基因、KAP2和H3me3K9共占ZNF基因，和由KAP1和H3me3K9共占的KRAB-ZNF基因。晶须显示2.5%和97.5%。对于这些分析，使用了两个独立实验的平均RNA表达值。
图6
图6。利用全基因组拼接阵列鉴定Ntera2细胞KAP1靶点
（A） ●●●●。显示了包含ZNF基因簇的19号染色体（和一个200-kb亚区）上的KAP1结合模式。染色体位置（Mb）显示在x轴上。黑色条表示ZNF433的转录区，灰色条表示其他转录区（类ZNF转录物）。（B） 使用KAP1扩增子的单独生物复制品对六个KAP1结合位点进行PCR分析。4个KAP1结合位点位于19号染色体上ZNF基因的转录区（ZNF554、ZNF426、ZNF333和ZNF433），2个KAP1-结合位点位于7号染色体（ZNF479和ZNF679）上ZNF-基因TSS的100kb以上。第8号染色体的基因间区域被用作KAP1结合缺失的对照。与总染色质DNA相比，KAP1和H3me3K9富集；将IgG扩增子作为阴性对照进行分析。
图7
图7。全基因组KAP1靶点的功能注释
在消除没有注释的基因和编码假想蛋白质的基因后，使用DAVID程序确定KAP1靶基因的功能类别。前十大类别第页-显示值。本体术语显示在y轴上；第页-富集显著性的值沿x轴绘制。
图8
图8。全基因组KAP1靶点的定位分析
（A） 显示了加利福尼亚大学圣克鲁斯KnownGenes（HG17）KAP1结合位点和最近转录起始位点之间的距离分布。计算从KAP1结合位点的中心到转录起始位点的距离，并在TSS上游50kb和下游50kb之间以5kb的间隔进行装箱。每个区间内的KAP1结合位点以ZNF靶基因（灰色）和KAP1靶基因的百分比表示，不包括ZNF基因（黑色）。（B） ZNF基因转录区内277个KAP1结合位点的分析。绘制KAP1结合位置相对于ZNF靶基因的长度（5′端为0%；3′端为100%）。
图9
图9。KRAB-ZNF的自动调节模型
所示模型说明了KRAB-ZNF家族通过KRAB-Z介导的KAP1募集到其他KRAB-ZNF基因编码区的自动调节。ZNF426、ZNF333和ZNF533是KAP1靶点，在Ntera2细胞中不表达。
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