跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2007年7月15日；16(14):1728-41.
doi:10.1093/hmg/ddm121。 Epub 2007年5月21日。

软骨生长板中软骨细胞增殖减少和细胞凋亡失调是由matn3突变引起的骨骺发育不良小鼠模型的关键特征

马修·普·莱顿 1, Seema Nundall公司, 托拜厄斯·斯塔堡, 罗杰·斯梅多斯, 法哈娜·苏勒曼, 勒奈特·诺尔斯, 雷蒙德·瓦格纳, 大卫·J·桑顿, 卡尔·E·卡德勒, 雷蒙德·布特·汉福德, 迈克尔·D·布里格斯
附属公司

软骨生长板中软骨细胞增殖减少和凋亡失调是matn3突变所致小鼠骨骺发育不良模型的主要特征

马修·普·莱顿等。 人类分子遗传学. .

摘要

软骨内骨化的破坏导致骨形成延迟和不规则，并可能导致一组异质性遗传疾病，称为软骨发育不良。其中一种疾病是多发性骨骺发育不良（MED），其特征是轻度侏儒症和早发性骨关节炎，可能由编码基质蛋白-3（MATN3）的基因突变引起。为了确定支持MED病理生理学的疾病机制，我们通过敲入matn3突变建立了一个骨骺发育不良小鼠模型。突变纯合子小鼠发展为进行性异型增生和短肢侏儒症，其严重程度与相关人类表型一致。突变的基质蛋白-3保留在软骨细胞的粗面内质网中，并与未折叠蛋白反应相关。最终，软骨生长板中软骨细胞的增殖减少和凋亡空间失调，这可能是突变小鼠线性骨生长中断和由此导致的短肢侏儒症的原因。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
生成材料3p.Val194Asp敲入小鼠模型。(A类)1：小鼠的基因组组织物料3基因；单个外显子用黑框表示并按顺序编号。2：目标结构洛克斯P序列用箭头表示，突变位点用星号表示。尼奥，新霉素电阻盒；TK、，胸苷激酶基因。3：同源重组等位基因和4：重组等位cre公司转染。相关限制场所为：S，Spe公司我；P、，磅/平方英寸OMI；B、，巴姆你好；C、，克拉我；N、，不是I.Probe指用于Southern blot检测野生型和同源重组突变体的外部探针物料3等位基因。(B类)转染ES细胞的Southern印迹分析。中所示的探针(A类)用Spe公司野生型和敲入型等位基因分别为I；1、同源重组；野生型等位基因。(C类)PCR扩增包含突变的区域，然后用克拉I.p.Val194Asp突变引入了克拉I限制位点和突变阳性同源重组克隆显示存在两个额外的消化产物（1，野生型；2，同源重组）。(D类)突变阳性同源重组体的测序证实了突变的存在（GTG>GAT）。小箭头显示用于常规基因分型的引物的位置。
图2
图2
野生型小鼠和杂合或纯合小鼠的表型特征物料3p.Val194Asp突变。(A类)整个新生儿骨骼的阿尔西安蓝（软骨）和茜素红（骨）染色。在杂合（wt/m）或纯合（m/m）小鼠中未观察到突变的显性表型。(B类)小鼠生长曲线。所有小鼠在第21天的体重都正常，但从第21天开始，与wt和wt/m小鼠相比，m/m小鼠的生长速度降低，最终导致到第63天体重减少9.4%(n个>每个基因型23只小鼠**P（P）单向方差分析显示<0.01）。(C类)第42天野生型小鼠和纯合p.Val194Asp小鼠的射线照片证实，突变纯合小鼠比野生型小鼠短。白色虚线在m/m鼠标的鼻尖和骨盆顶部对齐。(D类)14日龄雄性小鼠的内眦距离（ICD）和胫骨的骨长测量结果表明，与同窝体重的雄性小鼠相比，长骨生长减少(n个>6只小鼠**P（P）单向方差分析显示<0.01）。(E类)21天、42天和36天时胫骨的骨长测量。21日龄时，最大减少约12.5%(n个>6只小鼠**P（P）单向方差分析显示<0.01）。肱骨、骨盆和股骨的骨长度也有类似的减少（数据未显示）。在所有时间点，三种基因型的ICD之间均无统计学差异。
图3
图3
胫骨生长板的组织学和免疫组织化学（IHC）分析显示生长板形态受到破坏，突变的基质-3蛋白保留。(A类)野生型（wt）小鼠和杂合型（wt/m）或纯合型（m/m）小鼠的新生儿（NB）、7天和21天龄胫骨生长板的H&E染色用于突变（PFA固定6μm切片）。新生小鼠的生长板没有明显的异型增生。然而，从第7天开始，特别是在第21天，m/m小鼠的增殖区被破坏，具有无组织的柱（插入物）和一些低细胞区域。(B类)在体重、体重/米和米/米小鼠NB、第7天和第21天的胫骨生长板上使用抗基质蛋白-3抗体进行IHC（乙醇/乙酸混合6μm切片）。NB小鼠肥大区软骨细胞纯合突变显示保留了突变的基质蛋白-3。到第7天，这种滞留更为普遍，并影响生长板的所有区域。到第21天，基质中的苦参素-3的保留量变得更广泛，染色水平显著降低。到第21天因突变而杂合的小鼠也表现出低水平的苦参碱-3保留量，但ECM中苦参素3的量似乎在正常范围内。
图4
图4
对野生型小鼠和杂合或纯合突变小鼠7天龄胫骨生长板的超微结构分析表明，突变小鼠的rER个体池增大，软骨细胞形态发生改变。(A类)这组具有代表性的图像选自第7天胫骨生长板的完整TEM蒙太奇照片（从休息区到矿化区）。显示了静息区（R）、增殖区（P）和肥大区（H）。m/m小鼠R区的软骨细胞显示rER的单个池增大（星号）。在P区，增大的池在单个软骨细胞中更为广泛。wt/m小鼠的软骨细胞显示rER池扩张（星号），但软骨细胞的整体形态在正常范围内。比例尺=5μm（R和P）或10μm（H）。(B类)第7天胫骨生长板增殖（P）区和增生前（PH）区区域间基质的TEM。wt小鼠增殖区的细胞外基质（ECM）显示出具有高水平表面相关蛋白的胶原原纤维。m/m小鼠的纤维表面涂层较少。wt/m样品的外观与wt相似。比例尺=500 nm。
图5
图5
突变纯合小鼠的软骨细胞增加了rER体积。对野生型小鼠和突变纯合子小鼠的细胞（第7天）进行连续切片重建，以获得4细胞软骨蛋白的三维虚拟表示。根据该模型评估了形态差异，特别是对软骨细胞（549.25μm）进行了计算三/野生型和476.5μm软骨细胞三/突变体软骨细胞），细胞核（76.5μm三/野生型和94μm软骨细胞三/突变体软骨细胞）和扩张的rER体积（7.3μm三/野生型和55.3μm软骨细胞三/软骨细胞突变）。顶部面板显示了野生型和突变生长板连续切片的典型TEM图像。颜色显示了不同细胞结构的轨迹，并与重建有关。中间的面板显示了野生型和突变小鼠4细胞软骨的三维重建[软骨细胞1（关节面侧）：蓝色，软骨细胞2：黄色，软骨细胞3：绿色，软骨细胞4：红色（小梁骨侧）]。底部面板显示软骨细胞的内部结构。突变小鼠软骨细胞中扩张的rER数量明显增加（细胞核：紫色；扩张的rER:淡蓝色；初级纤毛管：红色）。比例尺=5μm。
图6
图6
突变基质蛋白-3的积累在软骨细胞中引发未折叠的蛋白质反应。(A类)在第4天，通过对从突变和野生型软骨细胞分离的mRNA进行qRT-PCR分析，测定UPR-相关伴侣的mRNA水平（BiP和GRP94；参见引物序列方法）。该图表明，与野生型软骨细胞相比，突变软骨细胞中的mRNA水平相对增加，在这两种情况下，mRNA水平均与18s RNA标准化。突变小鼠的BiP和Grp94 mRNA水平分别增加了2倍和4倍以上[n个=3只小鼠；三个独立的重复实验t吨-测试，P（P）<0.05（*）或P（P）< 0.01 (**)]. (B类)从等量的野生型或突变软骨细胞（2×10）中分离出的总细胞蛋白5细胞）通过SDS-PAGE和Western blot分析，使用针对BiP（约76kDa）和Grp94（约94kDa。在第4天突变纯合子小鼠中，两种伴侣的蛋白质水平均升高。(C类)通过qRT-PCR测定突变软骨细胞中CHOP mRNA的相对水平。与野生型相比，在第3天和第5天，突变软骨细胞中CHOP的表达没有明显上调(n个=每个基因型3只小鼠；三个独立的独立实验t吨-测试）。
图7
图7
突变生长板中的细胞增殖和凋亡受到显著影响。(A类)在处死前2小时，给21日龄小鼠注射0.01 ml/g核苷酸类似物BrdU。将小鼠的胫骨样本作为正常标本进行处理，并在乙醇固定的6μm切片上使用抗BrdU抗体进行IHC。通过比较BrdU标记细胞核的数量与增殖区软骨细胞的总数（即甲基绿标记细胞核+BrdU标签细胞核），计算BrdU-标记细胞核的比例。小鼠纯合子物料3与野生型和杂合子小鼠相比，p.V194D突变的小鼠增殖率显著降低(n个>每个基因型36个片段，独立t吨-测试**P（P）< 0.01). 使用DeadEnd™荧光TUNEL系统测量21天龄小鼠胫骨（PFA固定6μm切片）的末端凋亡（DNA片段）。(B类)通过比较凋亡软骨细胞（FITC-标记细胞核）的数量和肥大区软骨细胞的总数（DAPI标记细胞核+FITC-标签细胞核）来计算凋亡的相对水平。(C类)显示DAPI和FITC染色切片的胫骨生长板代表性图像。白色圆圈突出显示TUNEL阳性软骨细胞，实线表示肥厚区的开始，虚线表示VIF。突变纯合子小鼠的细胞凋亡发生在远离VIF的地方。(D类)突变纯合子小鼠在VIF处的凋亡率为0.38%，而野生型小鼠为0.66%；整体下降>40%(E类)突变小鼠肥大区软骨细胞凋亡显著增加(n个>每个基因型20个片段，独立t吨-测试**P（P）< 0.05).
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. Shapiro IM，Adams CS，Freeman T，Srinivas V.肥大软骨细胞的命运：骨骺生长板中细胞凋亡和存活的微环境观点。《今日胚胎出生缺陷研究》。2005年；75:330–339.-公共医学
    1. Kornak U，Mundlos S.骨骼遗传障碍：一种发育方法。Am.J.Hum.遗传学。2003;73:447–474.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Goldring MB，Tsuchimochi K，Ijiri K。软骨生成的控制。J.细胞。生物化学。2006;97:33–44.-公共医学
    1. Zelzer E，Olsen BR。骨骼疾病的遗传基础。自然。2003;423:343–348.-公共医学
    1. 骨组织学疾病国际工作组骨软骨发育不良的国际命名和分类。美国医学遗传学杂志。1998;79:376–382. 1997-公共医学

出版物类型