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比较研究
2007年5月;39(5):596-604.
doi:10.1038/ng2032。 Epub 2007年4月15日。

全基因组关联研究确定了新的克罗恩病易感性位点,并暗示自噬在疾病发病机制中的作用

附属机构
比较研究

全基因组关联研究确定了新的克罗恩病易感性位点,并暗示自噬在疾病发病机制中的作用

约翰·D·里奥等。 自然基因 2007年5月

摘要

我们提出了回肠克罗恩病的全基因组关联研究和两项独立的复制研究,以确定与克罗恩病关联的几个新区域。具体来说,除了先前建立的CARD15和IL23R关联外,我们还确定了与10q21.1基因间区域和ATG16L1编码变异的强且显著重复的关联(组合P<10(-10)),后者最近也被另一组报道过。我们还报告了编码PHOX2B、NCF4和16q24.1(FAM92B)预测基因的基因组区域的变异与独立复制之间的强烈关联。最后,我们证明ATG16L1在肠上皮细胞系中表达,该基因的功能性敲除可消除鼠伤寒沙门氏菌的自噬。总之,这些发现表明自噬和宿主细胞对细胞内微生物的反应参与了克罗恩病的发病机制。

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数字

图1
图1。946例回肠CD患者和977例对照样本的全基因组关联结果
使用Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)检验对非犹太人和犹太人组合队列的单标记关联结果。每条染色体被描绘成不同的颜色,蓝线和红线分别表示基于Bonferroni多重检测校正的暗示阈值和显著阈值。为了校正病例和对照组之间的分层,需要应用适当的校正系数(λ1.06-1.07),但不会修改当前结果。
图2
图2。自噬成分在人细胞系和原代免疫细胞中的表达
采用实时定量PCR检测ATG5、7和16L1在多种人类免疫和上皮细胞系中的表达模式。A组-人类细胞系中ATG5的表达模式。ATG5似乎在所研究的细胞系中广泛表达,各细胞系的表达水平差异在1.5到4倍之间。B组-人类细胞系中ATG7的表达模式。ATG7的表达水平与ATG5的表达水平大致相当,但THP1细胞除外,其表达水平是SW480细胞的35倍。C组-人类细胞系中ATG16L1的表达模式。ATG16L1的表达也与ATG5和7的表达大致相似(但THP1细胞中的ATG7表达除外),在所测试的细胞系中表达水平存在中度差异(1.5到3.5倍)。D组-人类原代免疫细胞中ATG16L1的表达模式。在静息的人类免疫细胞RNA组(Clontech,CA)中,ATG16L1在T细胞区室中显示出明显的表达峰值,CD4+和CD8+细胞都表达高水平的转录物(比对照样品多15-20倍)。在CD19+细胞中检测到中等水平,在CD14+单核细胞和未分化单核细胞中检测出低水平。在所有情况下,实时定量RTPCR反应重复进行,并绘制平均值,误差条代表1个标准偏差。进行不含模板RNA的反应以控制反应污染(水对照)。通过与GAPDH对照组和绘制SW480或胎盘RNA等于1的任意相对表达单位(分别用于细胞系或原代细胞)进行比较,将表达水平归一化。所有RNA都是在没有刺激或激活的情况下从休眠细胞中分离出来的。
图3
图3。自噬需要ATG16L1沙门氏菌伤寒杆菌
面板A。用寡聚双链体转染HEK293细胞后48小时内,可实现对过度表达的标记ATG16L1的特异性siRNA敲除。用特异性siRNA构建物处理后,Western blotting检测不到Flag-ATG16L1的蛋白水平,但用对照双链体维持表达。面板B。转染后48小时内,HeLa细胞内的内源性ATG16L1 mRNA被siRNA 2有效地敲除。用siRNA双工体转染HeLa细胞并使其生长48小时,然后分离RNA并进行实时定量RT-PCR。数据归一化为GAPDH对照,siRNA控制mRNA水平设置为1.0。与对照双链相比,siRNA 2的mRNA转录减少了89%。RT-PCR反应一式三份,用代表1个标准偏差的误差条绘制平均值,结果代表两个独立实验。面板C。敲除ATG16L1可防止S公司HeLa细胞中的伤寒杆菌。用对照siRNA或双链2和LC3-GFP质粒联合转染HeLa细胞48小时后,用沙门氏菌伤寒杆菌SL1344,经固定和显微镜检查。显示了每个细胞被LC3+膜(自噬体)包裹的细菌的平均百分比和标准误差。细菌计数来自两个单独的实验,每个实验至少统计100个感染细胞。采用双尾学生T检验评估显著性,假设方差不相等。面板D。细胞内典型图像S公司在对照siRNA处理的细胞中,鼠伤寒杆菌通过LC3+膜表现出正常的自噬包囊,但当ATG16L1敲除受到影响时,自噬靶向性丧失。用LC3-GFP质粒和siRNA转染HeLa细胞,然后按上述方法感染。分离通道以显示LC3-GFP融合蛋白(自噬体标记)和S公司.Typhiumurium SL1344 dsRed2(SL1344),最后一列中有一个合并图像。第2行和第4行分别显示了第1行和第3行中标记的区域的放大视图。图像是使用共焦显微镜获得的,是在感染细胞的整个平面上拍摄的Z堆栈的平面投影。比例尺表示5μm。

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引用人

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工具书类

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