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.2007年3月26日；176(7):1035-47.
doi:10.1083/jcb.200607053。 Epub 2007年3月19日。

PDK1在调节内皮细胞迁移中的重要作用

卢卡·普里莫 1, 劳拉·迪·布拉西奥, 克里斯蒂娜·罗卡, 萨拉·德罗托, 罗伯托·皮娃, 布莱恩·沙夫豪森, 费德里科·巴斯索利诺
附属公司

PDK1在调节内皮细胞迁移中的重要作用

卢卡·普里莫等。 J细胞生物学. .

摘要

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷脂酰肌醇依赖性激酶1（PDK1）通过磷酸化AGC激酶家族的成员，包括PKB/Akt，在细胞信号传导中发挥着中心作用。我们现在提供的证据表明，PDK1对血管内皮细胞（EC）的运动至关重要，并且参与调节其趋化性。从缺乏PDK1的小鼠胚胎干细胞分化出的内皮细胞在体外完全失去迁移能力，从而对血管内皮生长因子-A（VEGF-A）产生反应。此外，PDK1（-/-）类胚体表现出明显的发育和血管缺陷，这可归因于细胞迁移减少。此外，PDK1的过度表达增加了VEGF-A诱导的EC迁移。我们提出了PDK1和Akt的空间分布模型，在该模型中，通过激活磷脂酰肌醇3-激酶，在质膜上合成磷脂酰肌糖醇3,4,5三磷酸，在极化内皮细胞的前沿招募两种蛋白质，并促进细胞趋化性。这些发现为PDK1及其底物Akt的空间定位建立了一种调节定向迁移的机制。

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数字

图1。
图1。
PDK1基因敲除影响EB早期血管发育和EB衍生EC迁移。（A） 从PDK1获得的EB的代表性相控图像+/+和PDK1−/−分化第0天和第3天的ES细胞。（B） EB PDK1+/+和PDK1−/−在分化的第3、7和10天用大鼠α-CD31抗体进行固定和间接免疫荧光分析；用Cy2-偶联驴α-大鼠IgG检测抗原-抗体复合物。EB PDK1衍生细胞的（C和D）FACS分析+/+和PDK1−/−在不同分化阶段（3、7和10天）分别评估CD31-和Flk1-阳性细胞的百分比；数据绘制为三个独立实验中阳性细胞百分比的平均值±SD。（E） ES细胞PDK1+/+和PDK1−/−分化为EB 3天；然后将其分解，并在纤维结合蛋白（20μg/ml）梯度与30 ng/ml VEGF-a结合（黑条）或不结合（白条）的情况下将细胞用于趋化性分析。计算迁移指数，将PDK1的数量指定为1+/+向纤维连接蛋白迁移的CD31-阳性细胞；数据绘制为五个独立实验的平均值±SD。VEGF-A刺激的EC-PDK有统计学意义（*，P<0.01）−/−与EC-PDK1相比+/+图像代表五个独立的实验。棒材，100μm。
图2。
图2。
PDK1的PH结构域对于EB中的血管形成和EB衍生的EC迁移至关重要。（A） EB PDK1+/+，PDK1PHKI/PHKI公司和PDK1155E/155E在分化的第3、7和10天用大鼠α-CD31抗体进行固定和间接免疫荧光分析；用Cy2-偶联驴α-大鼠IgG检测抗原-抗体复合物。图像是五个独立实验的代表。棒材，100μm。（B） 10 EB PDK1+/+，PDK1−/−，PDK1PHKI/PHKI公司和PDK1155E/155E在分化的第7天，用成像软件对5个不同实验进行分析，以测量管状结构的总长度。数据绘制为平均值±标准偏差。PDK的统计显著性（*，P<0.01）−/−和PDK1PHKI/PHKI公司EB与PDK1的比较+/+EB。（C） ES细胞PDK1+/+，PDK1PHKI/PHKI公司和PDK1155E/155E分化为EB 3天；然后将其分解，并在20μg/ml纤维连接蛋白梯度结合30 ng/ml VEGF-a（黑条）或不结合（白条）的情况下，将细胞用于趋化性分析。将PDK1的数量赋值为1，计算迁移指数+/+向纤维连接蛋白迁移的CD31-阳性细胞；数据绘制为五个独立实验的平均值±SD；VEGF-A刺激的EC-PDK1具有统计学意义（*，P<0.01）PHKI/PHKI公司与EC-PDK1相比+/+.
图3。
图3。
PDK1的过表达增强了VEGF诱导的EC迁移。（A） 感染携带野生型PDK1（PDK1）、膜靶向PDK1的逆转录病毒（PDK1caax）且不携带任何东西（载体）的EC，在存在10 ng/ml VEGF-A的情况下用于趋化性分析，添加在培养箱的下部隔间（培养基/VEGF-A）或上部和下部隔间中（VEGF-A/VEGF-A）。迁移指数是在没有刺激的情况下，为迁移的矢量细胞数量赋值1；数据绘制为六个独立实验的平均值±SD。VEGF-A刺激的EC-PDK1和PDK1caax与载体EC相比具有统计学意义（*，P<0.01）。（B） 将感染所示逆转录病毒的内皮细胞涂布在明胶上，加入或不加入100 ng/ml VEGF-A。进行时间推移视频显微镜检查，每10分钟记录一次图像，持续6小时。显示的速度值是来自三个不同实验的60个细胞的平均值。数据绘制为平均值±标准偏差。（C和D）细胞被血清剥夺2 h，然后用VEGF-A刺激或不刺激10 min；用所示抗体免疫印迹每种裂解液50μg。所示的蛋白质印迹是五个具有类似结果的实验的代表。
图4。
图4。
PDK1的促迁移作用需要其PH结构域及其催化活性。（A） EC感染的逆转录病毒携带PH域缺失的PDK1（ΔPH）、前50个氨基酸缺失的PDK1（Δ50）、PDK1激酶缺失（KD）、PIF袋中突变的PDK1（L155E）和不携带任何东西的逆转录酶病毒（载体）；这些细胞在存在VEGF-a梯度（10 ng/ml）的情况下用于趋化性分析。迁移指数是在没有刺激的情况下，为迁移的矢量细胞数量赋值1；数据绘制为六个独立实验的平均值±SD。VEGF-A刺激的EC-PDK1-Δ50和PDK1-L155E与载体EC相比具有统计学意义（*，P<0.01）。（B） 细胞被血清剥夺2h，然后用VEGF-A刺激或不刺激10min；用所示抗体免疫印迹每种裂解液50μg。所示的蛋白质印迹是五个具有类似结果的实验的代表。
图5。
图5。
PDK1的促迁移作用依赖于PI3K，需要Akt。（A） 用携带野生型PDK1、膜靶向PDK1且不携带任何东西（载体）的逆转录病毒感染的内皮细胞在10 ng/ml VEGF-A存在下进行趋化性分析；将50μM的PI3K抑制剂LY294002添加到下腔，与VEGF-A联合或不联合添加到上腔的细胞中。迁移指数是在没有刺激的情况下，为迁移的矢量细胞数量赋值1；数据绘制为六个独立实验的平均值±SD；与VEGF-A刺激细胞相比，LY294002处理+VEGF-A-刺激细胞具有统计学意义（*，P<0.01）。（B） EC-Akt-myr血清剥夺2 h，用50μm LY294002预处理或不预处理45 min，然后用30 ng/ml VEGF-A刺激或不刺激10 min；裂解细胞，用α-HA抗体免疫沉淀过表达的Akt-myr；用SDS-PAGE分离免疫复合物，并用指示抗体进行免疫印迹。使用分子成像仪ChemiDoc XRS进行了三个独立的实验，并使用Quantity One软件进行了密度分析。数据绘制为调整体积百分比的平均值±SD。VEGF-A刺激的细胞与对照组相比具有统计学意义（†，P<0.05），LY294002处理+VEGF-A刺激的细胞与VEGF-A刺激的细胞相比具有统计学意义（†，P<0.05）。Western blot显示了三个具有类似结果的实验的代表性。（C） 载体EC和EC-PDK1被携带Akt1 shRNA的慢病毒或载体感染；72小时后，在存在VEGF-a梯度（10 ng/ml）的情况下，将细胞用于趋化性分析。计算迁移指数，将值1分配给在没有刺激的情况下迁移的载体细胞的数量；数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。与相应的对照组相比，VEGF-A刺激shAkt1内皮细胞的统计显著性（，P<0.05）。用α-Akt1单克隆抗体免疫印迹每种细胞类型的50μg裂解物。Western blot显示了三个具有类似结果的实验的代表性。
图6。
图6。
PDK1在VEGF-A刺激后转位到膜。感染所示逆转录病毒的EC接种在涂有明胶的玻璃盖玻片上；然后用50 ng/ml VEGF-A去除血清并刺激（B、D和F）或不刺激（A、C和E）。然后用单抗α-PDK1（A–D）或单抗α-myc（E和F）固定细胞并进行间接免疫荧光分析；用Alexa Fluor 488偶联的驴α-小鼠IgG检测抗原-抗体复合物。棒材，10μm。所示图像代表了50%以上的观察细胞。（G） 对来自三个独立实验的总共200个细胞进行分析，以计算在质膜上显示PDK1染色的细胞百分比。数据绘制为平均值±SD。VEGF-A刺激的EC-PDK1与对照细胞相比具有统计学意义（*，P<0.05），VEGF-A-刺激的EC-PDK1caax和PDK1-ΔPH与VEGF-A刺激的EC-PDK1相比具有统计学显著性（，P<0.05。
图7。
图7。
PDK1以依赖PH域的方式定位在迁移EC的前沿，并在迁移MEF中与pT308Akt共定位。感染指示逆转录病毒的（A–C）EC以高密度接种在涂有明胶的玻璃盖玻片上；拖拽塑料吸管尖端穿过细胞表面，损伤单层细胞；向培养基中添加50 ng/ml VEGF-A。6h后，固定细胞，用单抗α-PDK1（A和C）或单抗α-myc（B）进行间接免疫荧光分析；用Alexa Fluor 488结合驴α-小鼠IgG检测抗原-抗体复合物。瞬时转染PDK1的（D–F）MEF以高密度接种在涂有明胶的玻璃盖玻片上；将塑料吸管尖端拖过细胞表面，损伤单层细胞；添加添加50 ng/ml PDGF的培养基。6h后，细胞固定并用单克隆抗体α-PDK1（绿色）和兔α-pT308Akt（红色）双重染色；用Alexa Fluor 488–偶联驴α-小鼠IgG和Alexa Fuor 555–偶联驴β-兔检测抗原-抗体复合物。所示图像代表了50%以上的观察细胞。方框区域是单元格前缘的放大图。棒材，10μm。
图8。
图8。
PDK1和Akt的空间分布调节趋化性。（A） 用携带膜靶向形式PDK1（PDK1caax）、Akt（Akt-myr）、PI3K-催化亚基p110（p110caax。计算迁移指数，将值1分配给在没有刺激的情况下迁移的载体细胞的数量。数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。与EC-vector相比，VEGF-A刺激的EC-PDK1、PDK1caax、Akt-myr、PDK1+Akt-myer（*，P<0.05）具有统计学意义，而与EC-PDK1+Akt-myr相比，VEGF-A刺激PDK1camax+Akt/myr（，P<0.05）具有统计意义。感染指示逆转录病毒的（B–I）EC以高密度接种在涂有明胶的玻璃盖玻片上；拖拽塑料吸管尖端穿过细胞表面，损伤单层细胞；向培养基中添加50 ng/ml VEGF-A。6h后，用单克隆抗体α-PDK1（B、D、F和h）或兔α-pT308Akt（C、E、G和I）固定细胞并进行间接免疫荧光分析；用Alexa Fluor 405结合驴α-小鼠或α-兔IgG检测抗原-抗体复合物。所示图像代表了50%以上的观察细胞。棒材，10μm。
图9。
图9。
提出PDK1对细胞定向迁移的作用模型。用VEGF-A刺激野生型内皮细胞可诱导PI3K的局部激活和PtdIns（3,4,5）P梯度的形成三（用绿色表示）从电池前部到后部，允许PDK1和Akt在前缘的极化定位和定向迁移；膜锚定PDK1的过度表达强烈增加了Akt的局部激活水平，从而增加了趋化性；相反，当内皮细胞过度表达PDK1caax和Akt-myr时，Akt的活化沿细胞膜均匀分布，内皮细胞迁移效率较低。箭头大小表示迁移指数。
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