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.2007年4月4日；26(7):1749-60.
doi:10.1038/sj.emboj.7601623。 Epub 2007年3月8日。

活性氧物种对自噬至关重要，并能特异性调节Atg4的活性

鲁斯·谢尔兹·舒瓦尔 1, Elena Shvets公司, Ephraim Fass公司, 哈盖·肖勒, 利多·吉尔, 兹武伦·埃拉扎尔
附属公司

活性氧物种对自噬至关重要，并能特异性调节Atg4的活性

鲁斯·谢尔兹·舒瓦尔等人。 欧洲工商管理硕士J. .

勘误表in

摘要

自噬是真核细胞降解和再循环大分子和细胞器的主要分解代谢途径。该途径在环境应激条件下、发育过程中和各种病理情况下被激活。在这项研究中，我们描述了活性氧（ROS）作为信号分子在饥饿诱导的自噬中的作用。我们发现饥饿刺激ROS的形成，特别是H（2）O（2）。这些氧化条件对自噬至关重要，因为用抗氧化剂处理可以消除自噬体的形成和蛋白质的降解。此外，我们确定半胱氨酸蛋白酶HsAtg4是H（2）O（2）氧化的直接靶点，并指定位于HsAtg 4催化位点附近的半胱氨酸残基为该调控的关键。这种调节突变体的表达阻止了细胞中自噬体的形成，从而为自噬过程的氧化还原调节提供了分子机制。

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数字

图1
图1
细胞在饥饿条件下积累ROS。(A类)CHO细胞在对照培养基中生长（见材料和方法）或饥饿3或13小时，然后在50μM DHE中培养，并按照材料和方法中的详细说明进行可视化。(B类)CHO细胞按照（A）中的方法生长，用5 nM MitoTracker Red在37°C下处理30分钟，清洗，用30μM DCFDA处理，并按照材料和方法中的详细说明进行可视化。(C)将生长在96周培养板中的HeLa细胞去除血清（αMEM）、完全饥饿（EBSS）或保存在对照培养基（α-MEM，10%FCS）中2 h，然后按照（B）中的方法用DCFDA处理细胞，随后在荧光仪中进行分析，如材料和方法中所述。(D类)根据材料和方法中的详细说明，对从荧光测量中收集的数据进行了分析。
图2
图2
ROS的形成部分发生在III类PI3K激活的下游。(A类)左图：HeLa细胞在存在或不存在100 nM沃特曼或10 mM 3MA的情况下饥饿2小时，然后用DCFDA处理并用上述荧光仪进行分析。右图：在不含或含有100 nM沃特曼或10 mM 3MA的α-MEM培养基或EBSS培养基中培养的细胞中测量长寿命蛋白质的降解率。数值表示为三次单独测定的平均值±标准差。(B类)来自两个单独克隆的WT MEF或Atg5（−/−）MEF在DCFDA治疗和可视化或荧光分析前饥饿2小时。
图3
图3
活性氧的积累对自噬至关重要。(A类)上图：稳定转染GFP-GATE-16的CHO细胞在有或无10mM NAC或1000μ/ml过氧化氢酶的情况下预培养10分钟，然后在有或没有这些药物的情况下饥饿2小时，或在含有这些药物的对照培养基中生长2小时。然后固定细胞，渗透并用抗GFP单克隆抗体染色。显示了具有代表性的图像。下面板：HEK 293细胞转染GFP-GATE-16。在转染后24小时，用NAC或过氧化氢酶处理细胞并如上所述饥饿，在Ripa缓冲液中裂解，并在10%SDS-PAGE上分离100μg每种裂解产物，随后用抗GFP抗体进行分析，以检测转染的GATE-16和抗微管蛋白抗体作为对照。使用NIH图像程序对数据进行量化，并将其描述为总GATE-16中脂蛋白的百分比。(*)表示非lipidated和(**)表示固定的GFP-GATE-16。(B类)用NAC或过氧化氢酶处理并饥饿的CHO细胞，如（A）所述，用DCFDA孵育并用共焦显微镜观察或用荧光仪分析，如图1所示。(C)在α-MEM培养基或EBSS培养基中培养的CHO细胞中，或在用10 mM NAC预处理10分钟或用1000μ/ml过氧化氢酶过夜后，测量长寿命蛋白质的降解率。给出了一个具有代表性的实验。
图4
图4
内源性Atg4的活性在营养饥饿时受到抑制。(A类)CHO细胞（哺乳动物Atg8s）或酿酒酵母（对于ScAtg8）在饥饿培养基（分别为EBSS或SD-N）中培养不同的时间段，如材料和方法中所述，在使用Tri-reagent分离RNA之前所示。对于每个基因，从非靶细胞获得的数据被设置为任意值1，相应饥饿细胞的结果被相应地归一化。结果表示三个单独实验的平均值±标准差。(B类)HEK 293细胞在对照培养基中生长，或在没有或存在100 nM巴非霉素A1的情况下在EBSS中饥饿2 h。在Ripa缓冲液中获得的裂解物（100μg）在12%SDS-PAGE上运行，并使用抗GATE-16或抗微管蛋白抗体通过蛋白质印迹进行分析。(C)CHO细胞在有或无1mM H的对照培养基中生长2O（运行）21小时，或饥饿3或13小时。在Ripa缓冲液中获得的裂解产物（10μg）与重组His孵育6-GATE-16-HA（0.3μg）置于50 KT反应缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4，50 mM KCl）中，在30°C下放置45分钟，存在或不存在1 mM DTT。通过添加样品缓冲液和煮沸停止反应，然后在15%SDS-PAGE上解析样品，然后使用抗-His单克隆抗体进行Western blot分析。实验重复六次；显示了一个具有代表性的斑点。(D类)左图：转染Myc-GATE-16-HA或空白载体作为对照的HeLa细胞被标记为[35S] 蛋氨酸10分钟后立即溶解或在Ripa缓冲液中追赶1小时后溶解。使用抗Myc抗体对裂解液进行免疫沉淀，免疫沉淀在15%SDS-PAGE上进行解析。中间面板：将转染Myc-GATE-16-HA的HeLa细胞保存在对照培养基中或在EBSS中饥饿30分钟或13小时，然后用[35S] 蛋氨酸10分钟，立即裂解，通过SDS–PAGE进行分析，并使用NIH图像程序进行定量（右图）。数值表示为总GATE-16中无质控形式的平均百分比。(*)在这幅图的所有部分中，都表示他的6-GATE-16-HA或Myc-GATE-16-HA和(**)表明劈开了他的6-GATE-16或Myc-GATE-16。
图5
图5
H（H）2O（运行）2直接抑制HsAtgA的活性。(A类)通过培养重组His来测试裂解活性6-HsAtg4A（0.1μg）和His6-GATE-16-HA（0.3μg）在50 KT反应缓冲液中，30°C，在指定浓度的DTT存在下放置45分钟，然后使用抗-His单克隆抗体进行Western blot分析。使用Bio-Read Multi-Analyyst程序用密度计对三个单独实验产生的谱带进行量化，并将其表示为总GATE-16中裂解形式的平均百分比。(*)表示没有劈开他的6-GATE-16-HA和(**)表明劈开了他的6-大门-16。(B类)他的6-HsAtg4A在200μM DTT存在下于4°C孵育10分钟6-然后在50 KT中培养HsAtg4A（0.1μg）（以获得15μM DTT），H的指示浓度为2O（运行）2在25°C下保持5分钟，然后重组His6-添加GATE-16-HA（0.3μg），并在30°C下孵育45分钟。对三个单独实验的反应混合物进行了分析，并如（A）所述。(C)他的6-HsAtg4A（0.1μg）与重组His孵育6-GATE-16-HA（0.3μg），在以下程序后：不处理（1道）；在25°C下用200μM DTT预处理5分钟（第2车道）；用200μM DTT治疗，然后用1 mM H治疗2O（运行）2在25°C下保持5分钟（泳道3）；用200μM DTT治疗，然后用1 mM H治疗2O（运行）2持续5分钟，然后进行2 mM DTT（车道4）。反应混合物用抗-His单克隆抗体进行Western blot分析。
图6
图6
Atg4的四足同源物共享几个保守的半胱氨酸残基。(A类)Atg4家族成员中活性半胱氨酸残基周围区域的氨基酸排列。以下登录号的序列对齐：BAB83890、BAB83889、NP_777364、NP_77 7363、NP_001001171、CAG32326、AAH73017、AAH82660、AAH95617、XP_393739、NP_ 608563、XP_661074、NP_014176和NP_191554。使用ClustalX多重校准程序进行校准，并由ESScript 2.0程序描述，用黑色框架表示身份，用灰色背景表示同源性。编号依据HsAtg4B序列。根据最近解决的HsAtg4B（Sugawara）结构，在该区域发现α-螺旋和β-片等, 2005; 库马诺米杜等，2006）分别标记为黑色椭圆和灰色箭头。催化半胱氨酸残基用宽黑色箭头标记；其他保守的半胱氨酸用黑色细箭头标记。(B类)使用NJplot程序（Perriere和Gouy，1996），基于（A）中的比对创建了系统发育树。显示了指示树分支可靠性的引导值（最大值为1000）。
图7
图7
Cys81突变降低HsAtg4A的氧化还原敏感性在体外. (A类)重组His6-HsAtg4A型重量，他的6-HsAtg4A型C77A型或他的6-HsAtg4A型C81S公司（0.1μg）与His孵育6-GATE-16-HA（0.3μg）在50 KT反应缓冲液中，30°C，在有或无1 mM DTT的条件下放置45分钟。反应混合物用抗-His单克隆抗体进行Western blot分析。(*)表示没有劈开他的6-GATE-16-HA和(**)表明劈开了他的6-门-16。(B类)他的6-HsAtg4A型C81S公司（0.1μg）与重组His孵育6-GATE-16-HA（0.3μg）遵循图5C中详述的相同程序。对反应混合物进行了分析，如（A）所述。
图8
图8
Cys 81是细胞内HsAtg4A氧化还原调节所必需的。(A类)用HsAtg4A瞬时转染稳定表达GFP-GATE-16的CHO细胞重量-Myc His公司6或HsAtg4AC81S公司-Myc-His公司6转染后24小时，细胞饥饿2.5小时，然后固定、渗透并与抗Myc单克隆抗体孵育。上面板：用共焦显微镜观察到的用上述构建物转染的细胞的典型图像；典型的自噬体用箭头表示。下图：不同转染子中每个细胞的自噬体平均数量的量化。使用尼康日食TE300荧光显微镜观察固定细胞的图像，并用于量化每个细胞的自噬体数量。给出的结果是三个单独实验中总共100个细胞的平均值±标准差。(*)表示重要性P（P）<0.001. (B类)左面板：HEK 293细胞与GFP-GATE-16和（A）中提到的每个Atg4A结构共同转染。转染后40 h，细胞饥饿2.5 h，在Ripa缓冲液中裂解，并将100μg每种裂解液加载到10%SDS-PAGE中，随后用抗GFP抗体分析以检测转染的GATE-16，用抗Myc抗体检测转染后的HsAtg4A和抗微管蛋白抗体作为对照。(*)表示非脂化GFP-GATE-16和(**)表示固定的GFP-GATE-16。右面板：使用NIH图像程序分析三个单独实验的结果，如左面板所示，并量化如下：计算每个实验中每个突变株GFP-GATE-16总GFP-GATE-16中的脂质量。HsAtg4A的值重量在每个实验中，将其设定为100%，并相应计算转染突变体的细胞的相对脂质化。
图9
图9
饥饿期间，HsAtg4B受到氧化还原调节，其机制与HsAt4A类似。(A类)用GFP-HsAtg4B瞬时转染HeLa细胞重量或GFP-HsAtg4BC78S公司在转染后24小时，细胞在4 mM h的存在下饥饿2.5小时2O（运行）2之后将它们固定、透化并与抗LC3多克隆抗体一起孵育。如图8所示，对细胞进行可视化（上面板）和量化（下面板）。代表性的自噬体在上面板中用箭头表示。下部面板中显示的结果是三个单独实验中总共100个细胞的平均值±标准差。(*)表示重要性P（P）<0.001. (B类)左图：在Ripa缓冲液中裂解转染并按（A）处理的HeLa细胞，并将40μg每种裂解物加载到12%SDS–PAGE中，随后用抗LC3抗体和抗GFP抗体进行分析，以检测转染的HsAtg4B和抗微管蛋白抗体作为对照。(*)表示非脂化LC3和(**)表示脂化LC3。右面板：如左面板所示，对三个独立实验的结果进行了分析，如图8B所示。
图10
图10
自噬氧化还原调节的拟议模型。
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中的注释

  • 氧化作为调节自噬的翻译后修饰。
    谐谑曲-Shouval R、Shvets E、Elazar Z。 Scherz-Shouval R等人。 自噬。2007年7月至8月；3(4):371-3. doi:10.441/auto.4214。Epub 2007年7月2日。 自噬。2007 PMID：17438362

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  • 氧化是一种调节自噬的翻译后修饰。
    谐谑曲-Shouval R、Shvets E、Elazar Z。 Scherz-Shouval R等人。 自噬。2007年7月至8月；3(4):371-3. doi:10.4161/auto.4214。Epub 2007年7月2日。 自噬。2007 PMID：17438362
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