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审查
.2007年1月；87(1):315-424.
doi:10.1152/physrev.00029.2006。

一氧化氮和过氧亚硝酸盐在健康和疾病中的作用

帕尔·帕切尔 1, 约瑟夫·贝克曼, 卢卡斯·利奥黛特
附属公司
审查

一氧化氮和过氧亚硝酸盐在健康和疾病中的作用

帕尔·帕切尔等。 生理学评论. 2007年1月.

摘要

哺乳动物细胞具有合成自由基一氧化氮（NO）的能力，这一发现极大地推动了生物学和医学所有领域的科学研究。自其早期被描述为内皮衍生舒张因子以来，NO已成为调节几乎所有关键细胞功能的基本信号装置，以及在多种条件下细胞损伤的有效介质。最近的证据表明，NO的大部分细胞毒性是由于NO与另一自由基超氧阴离子之间的扩散控制反应产生的过氧亚硝酸盐所致。过氧亚硝酸盐通过直接氧化反应或通过间接的、自由基介导的机制与脂质、DNA和蛋白质相互作用。这些反应引发细胞反应，从细胞信号的细微调制到过度氧化损伤，导致细胞坏死或凋亡。在体内，过氧亚硝酸盐的生成是中风、心肌梗死、慢性心力衰竭、糖尿病、循环性休克、慢性炎症疾病、癌症和神经退行性疾病等疾病的重要致病机制。因此，旨在消除过氧亚硝酸盐的新型药理策略可能是未来强有力的治疗工具。本文详细介绍了支持NO和过氧亚硝酸盐这些新作用的证据。

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图1
图1
超氧化物、过氧亚硝酸盐和羟基自由基在其估计的第一个半衰期内的细胞扩散。这些圆圈表示点源中每个物种的浓度将降低50%的程度。过氧亚硝酸盐的扩散解释了其与二氧化碳和细胞内硫醇的快速反应。一氧化氮的扩散距离是根据其体内1s的半衰期计算的，这主要是由于其扩散到红细胞中。羟基自由基的扩散距离大约与小蛋白质的直径相同，或比过氧亚硝酸盐小10000倍。所有这些估计都涉及许多近似值，但将估计半衰期改变10倍只会使直径改变10倍或3.2倍的平方根。
图2
图2
一氧化氮与超氧物与氧气反应生成氧化剂的比较。这两种反应通常被赋予同等的权重，但由于速率的巨大差异，这掩盖了氧化剂生成的巨大差异。由于过氧亚硝酸盐的形成取决于一氧化氮和超氧物浓度的乘积，因此形成速度与面积成正比。左侧：如果细胞产生10 nM的一氧化氮，足以激活鸟苷酸环化酶，导致至少10%的血管舒张，则使用0.1 nM的超氧物作为超氧物基本稳态浓度的估计值，估算细胞液中过氧亚硝酸盐的形成（777）。赖特：如果超氧物生成增加100倍（黄色）或1000倍（黄色或橙色），过亚硝酸根生成增加，NADPH氧化酶激活后可合理增加。一氧化氮只增加了10倍，可能上升到约1μM在高度愤怒的州。最右边（橙色方块）：100 nM一氧化氮与氧气反应生成二氧化氮的比例面积（估计为50μ单元格中的M），放大100倍。该速率是在疏水膜中发生的较快速率，并且在溶液中会小300倍（784）。与一氧化氮与氧气的反应相比，刺激超氧化物合成的途径大大增加了氧化剂的生成。
图3
图3
一氧化氮的化学结构介于氧分子和氮分子之间。这个点表示一氧化氮上的未配对电子和氧气上的两个未配对电子。这些未配对电子处于反键轨道，抵消了氮气的三个键轨道特征。因此，一氧化氮实际上有2.5个键，并且核之间的距离稍长。氧只有两个键，核内距离更长。
图4
图4
一氧化氮扩散到吞噬体和过氧化亚硝酸盐衍生亚硝酸盐的再循环。只有极少量的细胞外液被吞噬细胞的液泡吞噬，而吞噬细胞液泡为髓过氧化物酶提供了有限的氯化物作为底物。相反，一氧化氮可以很容易地扩散到吞噬溶酶体中。中性粒细胞通过NADPH氧化酶产生超氧物，但超氧物不太可能穿透病原体的细胞膜或细胞壁，并且可以可逆地灭活髓过氧化物酶。过氧亚硝酸盐是髓过氧化物酶的底物，可以逆转这种抑制作用。此外，过氧亚硝酸盐分解形成的亚硝酸盐被包裹在吞噬体内，并作为髓过氧化物酶的额外底物。髓过氧化物酶不是巨噬细胞中的主要蛋白质，超氧化物和一氧化氮形成过氧亚硝酸盐似乎是细胞毒性的主要机制。
图5
图5
肺泡巨噬细胞产生过氧亚硝酸盐。当肺泡巨噬细胞被刺激产生超氧物和一氧化氮时，过氧亚硝酸盐会被定量产生（611），这可以通过产生的一氧化氮和超氧物的量以及消耗的氧气量来证明。细胞外高浓度添加超氧化物歧化酶（SOD）不会显著减少形成的过氧亚硝酸盐的数量，相反，它是酪氨酸硝化的催化剂。这表明，在膜表面产生的超氧物和通过膜扩散的一氧化氮在膜界面上反应如此迅速，以至于本体相的SOD无法竞争。
图6
图6
一氧化氮、超氧化物、过氧亚硝酸盐和二氧化氮的相互作用。当一氧化氮和超氧物同时存在时，它们也可能与二氧化氮反应生成N2O（运行）三和过氧硝酸盐。过氧硝酸盐分解产生亚硝酸盐和氧气，而N2O（运行）三可与硫醇反应生成亚硝基硫醇，或与氢氧根阴离子反应生成亚硝酸盐。Goldstein等人（452）表明，它还以扩散限制速率与过氧亚硝酸盐反应，生成两个二氧化氮分子和一个亚硝酸盐分子。当在中性pH下加入过氧亚硝酸盐时，这会形成一个循环，以产生更多的二氧化氮，并大大增加潜在反应的发生次数。在体内也会发生同样的反应，尤其是当一氧化氮的生成速度快于超氧化物时。
图7
图7
过氧亚硝酸盐介导细胞死亡的分子机制。许多病理条件与一氧化氮（NO）和O的同时生成有关2•−NO源仅限于各种NO合成酶的活性，而O2•−产生于多种来源，包括线粒体的电子泄漏、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶和NO合成酶的解偶联。一次NO和O通量2•−如果是近距离同时产生的，过亚硝酸根的生成会大大增加。过氧亚硝酸盐依赖性细胞毒性由多种效应介导，包括脂质过氧化、蛋白质硝化和氧化、DNA氧化损伤、基质金属蛋白酶（MMP）激活和一系列酶失活。线粒体酶特别容易受到过氧亚硝酸盐的攻击，导致ATP生成减少，并通过打开通透性转换孔诱导线粒体通透性转变，从而耗散线粒体膜电位（Δψ米). 这些事件导致电子传递和ATP形成停止，线粒体肿胀，线粒体外膜渗透，允许包括细胞色素在内的几种促凋亡分子流出c（c）和凋亡诱导因子（AIF）。反过来，细胞色素c（c）AIF激活一系列下游效应器，最终导致核DNA片段化。除了对线粒体的破坏作用外，过氧亚硝酸盐对DNA造成或多或少的严重氧化损伤，导致DNA链断裂，进而激活核酶聚ADP-核糖聚合酶（PARP）。活化的PARP消耗NAD来构建聚ADP核糖聚合物（PAR），聚ADP核糖聚合物本身通过聚ADP核糖糖水解酶（PARG）的活性快速代谢。一些游离PAR可能会离开细胞核，进入线粒体，在线粒体中放大AIF的线粒体外排（核与线粒体的串扰）。轻微的DNA损伤会激活DNA修复机制。相反，一旦发生过多的氧化和亚硝化应激诱导的DNA损伤，如在各种形式的再灌注损伤和其他病理生理条件下，如果PTP适度开放和PARP激活，细胞可能会通过凋亡来执行，同时保留细胞ATP，或者在PTP广泛开放和PARP过度激活的情况下通过坏死，导致NAD大量消耗和细胞ATP崩溃。[来源于Pacher等人（995），经Elsevier许可。]
图8
图8
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导和过氧亚硝酸盐刺激作用示意图。MAPK通过特定三肽基序的双重磷酸化激活，如左边由保守的蛋白激酶级联介导，涉及MAPK激酶（MAPKK或MKK）和MAPK激酶激酶（MAPK或MKKK）。上游MKKK的激活由各种细胞表面受体介导，包括G蛋白偶联受体（GPCR）和受体酪氨酸激酶（RTK），如表皮生长因子受体（EGFR），它们激活一些小G蛋白，如Ras、Rho、Rac和Cdc42。哺乳动物细胞中存在三组MAPK，包括细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、p38 MAPK和c-Jun NH2-末端激酶（JNK），其上游信号中间产物包括raf-1和MKK1-2（ERK途径）、MLK/Ask-1（混合谱系激酶/凋亡信号调节激酶-1）和MEK 3-6（p38），以及MLK-1/Ask-1和MK 4-7（JNK）。MAPK的下游靶点是转录因子、酶和各种蛋白质，它们调节细胞生长、凋亡以及炎症。西方人在底部显示了通过用增加浓度的过氧亚硝酸盐处理在心肌成肌细胞系H9C2中诱导的三种MAPK的激活模式，通过它们的磷酸化来证明。[改编自Pesse等人（1024）。]
图9
图9
一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸盐在心血管病理生理学中的作用。一方面，NO通过激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）-cGMP信号转导途径介导心血管系统中的各种生理/有益作用，包括血管舒张、抑制血小板聚集、抗炎、抗建模和抗凋亡作用。另一方面，在与氧化应激和炎症增加相关的病理条件下（心肌梗死、缺血性心脏病、心肌炎、心肌病、高血压等），NO和超氧化物（O2•−)反应形成过氧亚硝酸盐（ONOO−)它通过脂质过氧化、酶和其他蛋白质的氧化和硝化失活以及应激信号、基质金属蛋白酶（MMPs）等的激活诱导细胞损伤（另见表2）。过氧亚硝酸盐还触发细胞色素等促凋亡因子的释放c（c）线粒体中的凋亡诱导因子（AIF），介导caspase依赖性和非依赖性凋亡死亡途径。此外，过氧亚硝酸盐与其他氧化剂协同作用，导致DNA断裂，激活核酶聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）。轻微的DNA损伤会激活DNA修复机制。相反，一旦发生过度氧化和亚硝化应激诱导的DNA损伤，如各种形式的心肌再灌注损伤和心力衰竭，过度激活的PARP通过转移烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）中的ADP-核糖单位启动能量消耗循环+)核蛋白，导致细胞内NAD快速耗竭+和ATP池，减缓糖酵解和线粒体呼吸的速度，最终导致细胞功能障碍和死亡。聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG）降解聚（ADP核糖）聚合物，生成游离PAR聚合物和ADP-核糖。过度激活的PARP还促进多种炎症基因的表达，导致炎症增加和相关的氧化应激，从而促进心血管功能障碍和心力衰竭的进展。
图10
图10
过氧亚硝酸盐在心肌梗死中的作用。过氧亚硝酸盐清除剂MnTBAP可减小入口尺寸(A类)并抑制心肌3-硝基酪氨酸的形成(B类)在大鼠体内。【经爱思唯尔许可，摘自列夫兰德等人（750）。】
图11
图11
人类心肌炎症中硝基酪氨酸形成的证据。心肌炎、败血症或无心脏病患者（对照患者）心脏组织样本中的硝基酪氨酸免疫反应具有代表性。A类心肌炎患者心肌、血管内皮和血管平滑肌中硝基酪氨酸免疫反应（棕色染色）的低倍（×20）显微照片。B类败血症患者心肌、血管内皮和血管平滑肌中硝基酪氨酸免疫反应的低倍（×20）显微照片。注意结缔组织元件相对没有染色。C类：心肌炎患者心内膜炎心肌内强烈硝基酪氨酸免疫反应的高倍（×40）显微照片。D类败血症患者心内膜硝基酪氨酸免疫反应的高倍（×40）显微照片。E类：低倍（×20）显微照片，心肌中的微量硝基酪氨酸免疫反应，以及对照患者1C的血管内皮和血管平滑肌中的硝基酪氨酸实际无免疫反应。F类：对照组患者心内膜硝基酪氨酸免疫反应的高倍（×40）显微照片。G公司：低功率（×20）显微照片，显示在心肌炎患者组织染色之前，通过将一级抗体与10 mM硝基酪氨酸预孵育，对硝基酪氨酸免疫反应的抑制。H（H）：低倍（×20）显微照片，通过在脓毒症患者组织染色前将一级抗体与10 mM硝基酪氨酸预孵育，证明硝基酪氨酸免疫反应受到抑制。[经Lippincott Williams&Wilkins许可，来自Kooy等人（707）。]
图12
图12
心力衰竭的进展及氧化应激和过氧亚硝酸盐的作用。导致心力衰竭的机制有多种来源，包括急性和慢性缺血性心脏病、心肌病、心内膜炎和压力超负荷等等。这些疾病导致心脏承受的负荷与收缩所需的能量不匹配，导致机械能解耦。初次损伤后，次要介质如血管紧张素II（AII）、去甲肾上腺素（NE）、内皮素（ET）、促炎细胞因子[如肿瘤坏死因子-α（TNF-α)白细胞介素6（IL-6）与氧化应激和过氧亚硝酸盐协同作用，激活下游效应器（如PARP-1或MMPs），直接作用于心肌或通过血流动力学负荷条件的改变间接作用于心肌，导致内皮和心肌功能障碍、心脏和血管重塑、肥大、纤维化、，心脏扩张和心肌坏死，最终导致心力衰竭。不良重塑和外周阻力增加进一步加重了心力衰竭。基质金属蛋白酶；PARP-1，聚ADP-核糖聚合酶。[来源于Pacher等人（995），经Elsevier许可。]
图13
图13
过氧亚硝酸盐在阿霉素（DOX）诱导的心力衰竭中的作用。A类：小鼠注射DOX后5天出现严重心脏功能障碍的证据。典型光伏回路(顶部)和左心室压力信号(底部)来自对照组和DOX和DOX+INO-1001处理小鼠。请注意，DOX治疗动物的PV环向右移位，最大左心室压力降低，以及+dP/dt吨表明心脏收缩力下降。B类：过氧亚硝酸盐清除剂FP15（黑条）可减轻DOX诱导的（阴影条）急性（aDOX；单次剂量25 mg/kg ip）和慢性（cDOX；每10天3次剂量9 mg/kg ip，持续25天）心脏功能障碍。给药5（aDOX）或25（cDOX）天后测量血流动力学参数。结果是每组10-14个实验的平均值±SE*P（P）<0.05与CO#P（P）与aDOX或cDOX相比<0.05。C类：小鼠注射DOX后5天心肌硝基酪氨酸形成增加（广泛的深棕色染色），FP15降低。[来自Pacher及其同事（985988），获得Lippincott Williams&Wilkins和Demetrios A.Spandidos教授的许可。]
图14
图14
过氧亚硝酸盐放大炎症的机制。炎症由多种信号级联激活触发，最终导致一系列促炎细胞因子和趋化因子的上调产生。这些引发了一种更复杂的炎症反应，其特征是炎症细胞的激活和酶的刺激活性，包括产生大量NO的诱导型NO合成酶（iNOS）和超氧化物（O2•−)-产生酶NADPH氧化酶（NADPHox）和黄嘌呤氧化酶（XO）。NO和O的同时产生2•−导致产生过氧亚硝酸盐（ONOO−)进而损害目标分子，包括蛋白质、谷胱甘肽（GSH）、线粒体和DNA。DNA损伤可引发凋亡细胞死亡，也是激活聚ADP-核糖聚合酶（PARP）的强制性触发因素，PARP可通过ATP耗竭诱导细胞坏死。两种ONOO−如黑色箭头所示，PARP进一步参与炎症前信号转导通路的上调，从而产生炎症细胞损伤的自我放大循环。
图15
图15
NO和过氧亚硝酸盐在中风病理生理中的作用。脑缺血和再灌注导致内皮一氧化氮合酶（eNOS）活性的短暂刺激，导致内皮一氧化氮生成短暂增加，与中风的神经保护作用相关。与此同时，缺血能量消耗和氧化剂（ROS）的产生触发了谷氨酸的释放，从而导致细胞外（钙通道激活）和细胞内（磷酸肌醇-3-激酶-内质网信号）来源的神经元钙超载。由于一氧化氮合酶（nNOS）神经元亚型的活性受到刺激，钙超载导致NO合成延长。NO生成的增强还取决于诱导型NOS（iNOS）在各种类型的反应性炎症细胞中的表达，以及几种细胞信号通路（HIF-1、STAT-3和NFκB） 对缺氧、细胞因子、氧化剂和谷氨酸的反应。在同一时间段内，由于eNOS的解偶联、线粒体功能障碍以及NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶和环氧化酶-2（COX-2）的活性受到刺激，超氧物生成增强。过氧亚硝酸盐的形成明显受欢迎，它会破坏脂质、蛋白质、DNA，并触发聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的激活，这些都会导致中风的神经毒性。
图16
图16
糖尿病小鼠和大鼠各种组织中硝基酪氨酸形成的证据。对照组硝基酪氨酸的免疫组织化学染色（深棕色染色）(左边)和糖尿病(正确的)小鼠组织。[来源于Pacher等人（994）和Szabo等人（1234），经Feinstein医学研究所和边沁科学出版社许可。]
图17
图17
糖尿病心血管功能障碍的机制：超氧物和过氧亚硝酸盐的作用。高血糖导致超氧阴离子（O2•−)通过激活多种途径进行生产，包括黄嘌呤和NAD（P）H氧化酶、环氧合酶、非偶联一氧化氮合酶（NOS）、葡萄糖自氧化、线粒体呼吸链、多元醇途径和高级糖基化终产物（AGE）的形成。超氧化物激活AGE、蛋白激酶C（PKC）、多元醇（山梨醇）、己糖胺和应激途径，导致炎症细胞因子、血管紧张素II（Ang II）、内皮素-1（ET-1）和NAD（P）H氧化酶的表达增加，进而通过多种机制产生更多的超氧化物。高血糖诱导的超氧物生成增加也可能有助于通过激活NF增加一氧化氮合酶（NOS）的表达κB、 这可能会增加一氧化氮（NO）的生成。超氧阴离子可淬灭NO，从而降低有效内皮衍生血管扩张系统的功效。超氧化物也可以转化为过氧化氢（H2O（运行）2)通过超氧化物歧化酶（SOD）与NO相互作用形成活性氧化剂过氧亚硝酸盐（ONOO−)，通过脂质过氧化、酶和其他蛋白质的氧化和硝化失活以及基质金属蛋白酶（MMPs）的激活等诱导细胞损伤。过氧亚硝酸盐也作用于线粒体[降低膜电位（Ψ）]，触发细胞色素等促凋亡因子的释放c（c）（周期c（c）)和凋亡诱导因子（AIF）。这些因子介导caspase依赖性和caspase非依赖性凋亡死亡途径。过氧亚硝酸盐，与其他氧化剂（如H2O（运行）2)导致DNA链断裂，激活核酶聚ADP-核糖聚合酶-1（PARP-1）。轻微的DNA损伤会激活DNA修复机制。相反，一旦发生过度氧化和亚硝化应激诱导的DNA损伤，过度激活的PARP-1通过从NAD转移ADP-核糖单元（小红球）启动能量消耗循环+核蛋白，导致细胞内NAD快速耗竭+和ATP池，减缓糖酵解和线粒体呼吸的速度，最终导致细胞功能障碍和死亡。聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG）降解聚（ADP-核糖）聚合物，生成游离的PAR聚合物和ADP-核糖，可能向线粒体发出信号，诱导AIF释放。PARP-1激活还导致细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）活性受到抑制，而GAPDH活性反过来有利于PKC、AGE和己糖途径的激活，从而导致超氧物生成增加。PARP-1还调节多种炎症介质的表达，这可能促进糖尿病心血管并发症的进展。[摘自Pacher and Szabo（996），经Elsevier许可。]
图18
图18
糖尿病血管系统中硝基酪氨酸形成和PARP激活的证据。硝基酪氨酸免疫组化染色、末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（DNA断裂指示物）和多聚（ADP-核糖）（PARP活性指数）在糖尿病小鼠的控制环（顶行）和环（底行）中的表达。[来源于Garcia Soriano等人（430），获得自然出版集团的许可。]
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