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.2007年2月；117(2):326-36.
doi:10.1172/JCI28833。 Epub 2007年1月18日。

在Myc诱导的淋巴瘤模型中，自噬抑制增强治疗诱导的凋亡

拉维·K·阿马拉瓦迪 1, Duonan余, 朱利安·卢姆, Thi Bui公司, 玛丽亚·克里斯托弗, 杰拉德一世埃文, 安德烈·托马斯·蒂霍连科（Andrei Thomas-Tikhonenko）, 克雷格·B·汤普森
附属机构

在Myc诱导的淋巴瘤模型中，自噬抑制增强治疗诱导的凋亡

拉维·K·阿马拉瓦迪等。 临床研究杂志. 2007年2月.

摘要

自噬是一种溶酶体依赖的降解途径，在化疗或放疗的肿瘤细胞中经常被激活。在治疗后的癌细胞中观察到的自噬是一种允许肿瘤细胞存活治疗的机制，还是一种启动非凋亡形式的程序性细胞死亡的机制，仍存在争议。为了解决这个问题，研究了自噬在Myc诱导的淋巴瘤模型中的作用，该模型由p53ER（TAM）/p53ER（TAM）小鼠（ER表示雌激素受体）产生的细胞生成。由于缺乏核p53，这些肿瘤对凋亡具有抵抗力。全身应用三苯氧胺导致p53激活和肿瘤复发。p53的激活与凋亡细胞的快速出现和存活细胞自噬的诱导有关。氯喹或ATG5短发夹RNA（shRNA）抑制自噬可增强p53活化或烷基化药物治疗诱导肿瘤细胞死亡的能力。这些研究提供了证据，证明自噬在使用凋亡激活剂治疗的肿瘤细胞中起着生存途径的作用，并为自噬抑制剂（如氯喹）与旨在诱导人类癌症凋亡的疗法结合使用提供了理论依据。

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数字

图1
图1。CQ在p53激活和不激活的情况下对肿瘤细胞凋亡的影响Myc/p53ERTAM公司淋巴瘤。
(A类)CQ抑制肿瘤生长。主单元中的单元Myc/p53ERTAM公司在6只同系C57BL/6×129F1小鼠体内采集并传代肿瘤。将细胞皮下注射到小鼠两侧。当肿瘤体积超过1000毫米时三，小鼠每天接受PBS腹腔注射或60 mg/kg/d CQ腹腔注射。结果显示为平均±SD每日肿瘤体积，是多项实验的代表*P（P）<0.05。(B类)CQ在p53诱导的肿瘤消退后延迟肿瘤复发。Myc/p53ER基因TAM公司18只C57BL/6×129F1小鼠侧翼皮下注射细胞。一旦肿瘤体积达到1500毫米以上三，将小鼠分配给每日治疗（箭头），每天1 mg/d TAM腹腔注射加生理盐水（TAM/PBS）或1 mg/d TAM腹腔注射加60 mg/kg/d CQ腹腔注射（TAM/CQ）。结果显示了代表性实验中各组的每日肿瘤体积（平均值±标准偏差）*P（P）< 0.05; **P（P）<0.005。
图2
图2。有CQ和无CQ激活p53对自噬体积累的影响。
(A类)肿瘤消退过程中自噬体变化的时间进程。PBS或CQ单独治疗96小时后以及TAM治疗开始后8小时、24小时和48小时收集的淋巴瘤组织的电子显微照片。箭头，双膜囊泡。比例尺：2μm。原始放大倍数，×10000。(B类)自噬体增多的肿瘤细胞定量。对Myc/p53ERTAM公司根据所给治疗方案，在指定的时间点发生淋巴瘤。每个非凋亡细胞的自噬体数量按照方法（平均值±标准偏差）进行测定*P（P）<0.005。
图3
图3。有无CQ激活p53对细胞凋亡的影响。
(A类)p53激活后CQ诱导的细胞死亡。TAM治疗前和TAM/PBS或TAM/CQ治疗48小时后收集的淋巴瘤组织的电子显微照片。比例尺：10μm。原始放大倍数，×4000。(B类)利用凋亡形态学证据对肿瘤细胞进行量化。对Myc/p53ERTAM公司根据所给治疗方案，在指定的时间点发生淋巴瘤。按方法（平均值±SD）所述，在×4000倍放大下测定每个场的凋亡细胞百分比。(C)在指定的时间点对从治疗肿瘤获得的组织进行TUNEL染色。通过荧光显微镜获得了具有代表性的图像。红色荧光显示TUNEL阳性细胞。蓝色荧光显示细胞核DAPI染色。(D类)TUNEL阳性肿瘤细胞的定量。每个高倍视野中TUNEL阳性细胞的百分比报告为平均值±SD。
图4
图4。有和无CQ激活p53对LC3重定位的影响。
(A类–C)GFP-LC3荧光。绿色，GFP-LC3；蓝色，DAPI。(A类)初级教育的大量人口Myc/p53ERTAM公司对稳定表达GFP-LC3融合蛋白的淋巴瘤细胞分别给予250 nM hTAM和不给予250 nMhTAM，以及给予和不给予5μM CQ。每天更换细胞培养基。在24小时和48小时用荧光显微镜对细胞进行固定和成像。给出了48小时时细胞的代表性图像。(B类)量化每细胞（点状）具有4个以上GFP-LC3点状细胞的细胞百分比，与在24小时用增加剂量的CQ（含和不含hTAM）处理的每细胞（弥散）少于4个GFP-LC2点状细胞相比。(C)CQ以p53依赖的方式调节自噬。第53页+/+和第53页–/–表达GFP-LC3的MEF用CQ处理。24小时固定细胞并成像。
图5
图5。p53激活伴或不伴ATG5敲除对肿瘤细胞死亡的影响。
(A类)抗ATG5的蛋白印迹Myc/p53ERTAM公司/向量单元格（V），Myc/p53ERTAM公司/HC公司细胞（HC），Myc/p53ER码TAM公司/shATG5氢气电池（h2），以及Myc/p53ERTAM公司/shATG5小时7细胞（h7）。肌动蛋白被用作加载控制。(B类)激活p53HC公司和第5页细胞。HC公司,氢气、和h7（小时7）淋巴瘤细胞每天接受200 nM hTAM治疗。(C)激活p53和丙酮酸甲酯（MP）。HC公司,氢气、和h7（小时7）淋巴瘤细胞每天用hTAM加1 mM MP治疗(B类和C)每日计数台盼蓝排除法测定的活细胞数。报告值为代表性实验中一式三份样品的平均值±标准差。
图6
图6。CQ或ATG5敲低与p53激活联合对肿瘤细胞死亡的影响。
(A类)激活p53和CQHC公司细胞。HC公司淋巴瘤细胞每天用200 nM hTAM加1μM、3μM或5μM CQ治疗(B类)激活p53和CQ氢气淋巴瘤细胞。HC公司每天用hTAM处理细胞，并与氢气每天用hTAM或hTAM加1μM、3μM或5μM CQ处理细胞(C)激活p53和CQh7型淋巴瘤细胞。每天用hTAM处理HC细胞，并与h7（小时7）每天用hTAM或hTAM加1μM、3μM或5μM CQ处理细胞(A类–C)每日计数台盼蓝排除法测定的活细胞数。报告值为代表性实验中三份样品的平均值±SD。
图7
图7。添加和不添加CQ的烷基化化疗对Myc/p53ERTAM公司淋巴瘤。
(A类)从原发肿瘤中获取细胞，并在同基因C57BL/6×129F1小鼠体内传代。Myc/p53ERTAM公司将细胞皮下注射到小鼠两侧。一旦肿瘤达到1700毫米以上三根据肿瘤大小匹配小鼠，用50 mg/kg环磷酰胺腹腔注射一次，然后每日PBS腹腔注射（顶部面板）或60 mg/kg/d CQ腹腔注射（底部面板），共治疗13天。显示单个小鼠的每日肿瘤体积。CY，环磷酰胺。(B类)环磷酰胺/PBS和环磷酰胺/CQ处理小鼠的肿瘤复发时间（平均值±SD）*P（P）= 0.003. (C)GFP-LC3荧光。绿色，GFP-LC3；蓝色，DAPI。大量初级人口Myc/p53ER基因TAM公司用50μM MNNG处理稳定表达GFP-LC3融合蛋白的淋巴瘤细胞，加或不加10μM CQ。每天更换细胞培养基。在24小时和48小时用荧光显微镜固定细胞并成像。呈现了48小时时细胞的代表性图像。(D类)量化治疗后24小时和48小时，每个细胞（点状）具有4个以上GFP-LC3点的细胞百分比，与每个细胞（弥散）少于4个GFP-LC2点的细胞相比。(电子)MNNG在HC公司和第5页细胞。第0天，2×106细胞/mlHC公司,氢气、和h7（小时7）淋巴瘤细胞被镀上，并用20μM MNNG（红色）或20μM MINNG加5μM CQ（蓝色）处理。在处理24小时和48小时后，计数通过台盼蓝排除法测定的活细胞数。报告值是代表性实验三份样品的平均值±SD。
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