Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation

doi:10.1073/pnas.0610155104

.2007年1月16日；104(3):1027-32.

doi:10.1073/pnas.0610155104。 Epub 2007年1月5日。

体内电穿孔导入转基因的控制表达

松田高彦¹, 康斯坦斯·塞普科

附属公司

PMID： 17209010
预防性维修识别码：第764220页
内政部： 10.1073/pnas.0610155104

体内电穿孔导入转基因的控制表达

松田高彦等。美国国家科学院程序. 2007.

.2007年1月16日；104(3):1027-32.

doi:10.1073/pnas.0610155104。 Epub 2007年1月5日。

作者

松田高彦¹, 康斯坦斯·塞普科

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿路易斯·巴斯德大道77号哈佛医学院遗传与霍华德·休斯医学院。

PMID： 17209010
预防性维修识别码： PMC1764220型
内政部： 10.1073/pnas.0610155104

摘要

体内电穿孔是一种将基因引入生物体的强大技术。导入基因或RNAi表达的时间和空间调控将进一步提高该方法的实用性。在这里，我们证明了出生后大鼠视网膜和胚胎小鼠大脑中电穿孔质粒的基因表达的条件调控。为了进行时间调节，将Cre/loxP介导的诱导表达载体与表达条件活性形式的Cre重组酶的载体结合使用，该重组酶由4-羟基三苯氧胺激活。基因表达的开始受4-羟基三苯氧胺给药时间的调节。为了进行空间调控，转基因通过使用杆状光感受器、双极细胞、无长突细胞、米勒胶质细胞或祖细胞特异的启动子表达。这些结构的组合将促进各种实验，包括细胞类型特异性基因的错误表达、条件RNAi以及祖细胞和前体细胞的命运定位。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
使用可诱导Cre和Flp重组酶对视网膜中基因表达的时间调节。(A类)4OHT应答的Cre和Flpe（Flp的增强形式）重组酶由Cre/Flpe和ER（ER）的突变配体结合域组成^T2段)在CAG（带有巨细胞病毒增强子的鸡β-actin启动子）启动子（10）的控制下表达。(B类)CALNL-DsRed：依赖Cre/loxP的诱导表达载体。DsRed仅在Cre在场的情况下表达。CAFNF-DsRed：依赖Flp/FRT的诱导表达载体。DsRed仅在存在Flp的情况下表达。(C类)实验方案。(*D–G型*)P0大鼠视网膜与三种质粒共电穿孔：CAG-GFP（转染控制）、CALNL-DsRed(天,F类，以及*G公司*)，或CAFNF-DsRed(E类)作为重组指标和CAG-核心^T2段(天)，燃油箱CAG^T2段(E类)，或CAG-ER^T2段CreER公司^T2段(F类和*G公司*). 三种质粒以2:3:1的质量比混合（最终浓度为4.5μg/μl）。视网膜受到刺激，但没有(*D–F型*)或使用(*G公司*)在第20页通过静脉注射4OHT，然后在第21页收获。图中显示了收获视网膜的整装制剂。电穿孔面积显示，所有细胞中有5-15%为GFP阳性。(*H–K*)面板中显示的视网膜部分*D–G型*细胞核用DAPI染色。约90%(*H（H）*), 10% (我), 0% (J型)和60%(*K（K）*)GFP阳性细胞表达DsRed。

**图2。**
使用细胞型特异性启动子在视网膜中的基因表达。P0大鼠视网膜与两种质粒共电穿孔：CAG-GFP（转染控制）和视网膜细胞类型特异性启动子-DsRed。两种质粒以1:2的质量比混合（最终浓度为6.0μg/μl）。视网膜在第20页采集(*A–H*和J型)或P2(我)切片，用DAPI染色。视紫红质启动子(A类)，编号(B类)、Crx(C类)，电缆5(天)，Ndrg4型(E类)、Cralbp(F类)，聚簇素(*G公司*)、Rax(*H（H）*)和Hes1(我和J型)用于表示DsRed。请注意，由Rax启动子驱动的DsRed在P20处未检测到，尽管在P2–P3处检测到较弱。

**图3。**
使用Cre/loxP系统和细胞类型特异性启动子在视网膜进行的线性追踪实验。P0大鼠视网膜与三种质粒共电穿孔：CAG-GFP（转染控制）、CALNL-DsRed（重组指示剂）和视网膜细胞类型特异性启动子-Cre。三种质粒以2:3:1的质量比混合（最终浓度为6.0μg/μl）。在第20页采集视网膜，切片，并用DAPI染色。视紫红质启动子(A类)，编号(B类)、Crx(C类)，电缆5(天)，Ndrg4(E类)、Cralbp(F类)，聚簇素(*G公司*)、Rax(*H（H）*)和Hes1(我)用于表示Cre。黄色箭头表示标记的杆。蓝色箭头表示标记的双极性电池。（英寸E类，由于无长突细胞中来自DsRed的非常强的信号和来自GFP的非常弱的信号，在GFP图像中存在来自DsRed的信号。）

**图4。**
Müller胶质细胞中的诱导表达。P0大鼠视网膜与三种质粒：聚簇素启动子-ER共电穿孔^T2段CreER公司^T2段CALNL-DsRed和CAG-GFP。三种质粒以1:3:2的质量比混合（最终浓度为6.0μg/μl）。(A类)实验方案。(B类)无4OHT刺激，在P16时采集转染视网膜的整体制备。(C类)在P14用4OHT刺激并在P16收获的转染视网膜的整体制备。(天)视网膜如图所示C类切片并用DAPI染色。平均0.7%的GFP阳性细胞表达DsRed。

**图5。**
视网膜中的可诱导RNA干扰。(A类)基于mir30的RNAi载体图。hU6-mir30：mir30表达盒的发夹茎由siRNA正、反义链（各22nt）、源自人类mir30（19nt）的环和发夹两侧的125-nt mir30侧翼序列组成。该盒在人类U6启动子的控制下表达。mir30初级转录物被处理以生成成熟的shRNA。CAG-mir30：mir30表达盒在CAG启动子的控制下表达。CALSL-mir30:Cre依赖性诱导型shRNA表达载体，携带固定的转录终止盒（3xpolyA信号序列）。在Cre存在的情况下，mir30表达盒在CAG启动子的控制下表达。(*B–F类*)293T细胞中基于mir30的GFP敲除载体的特征。(*B–D类*)将CAG-GFP和CAG-HcRed共转染到293T细胞中(B类)或使用(C类和天)基于mir30的RNAi载体，表达抗GFP的shRNA。(E类和F类)使用诱导型RNAi载体CALSL-mir30（GFPshRNA）(E类)或使用(F类)CAG-核心。293T细胞转染48小时后进行分析。(*G公司*和*H（H）*)视网膜中有条件的GFP敲除。CAG-GFP、CAG-DsRed和CALSL-mir30（GFPshRNA）共电穿孔(*G公司*)或使用(*H（H）*)视紫红质启动子-Cre进入P0大鼠视网膜。四种质粒以4:4:6:1的质量比混合（最终浓度为6.0μg/μl）。在P20时采集视网膜，切片并用DAPI染色。

**图6。**
Rax和Hes1在杆状光感受器中的靶向性错误表达。(A类和B类)使用传统表达系统在发育中的视网膜中Rax和Hes1的错误表达。CAG-最大(A类)或CAG-Hes1(B类)与CAG-GFP共电穿孔到P0大鼠视网膜。两种质粒以1:1的质量比混合（最终浓度为3.0μg/μl）。在P14处采集视网膜，切片，并用抗视紫红质抗体（红色）和DAPI（蓝色）染色。(C类)一幅示意图显示了棒状光感受器的分化过程。Nrl的表达先于视紫红质的表达。(天和E类)利用视紫红质启动子-Cre在杆状光感受器中错误表达Rax和Hes1。CALNL-最大(天)或CALNL-Hes1(E类)与视紫红质启动子-Cre和CALNL-GFP共同电穿孔到P0大鼠视网膜。三种质粒以2:1:2的质量比混合（最终浓度为5.0μg/μl）。在P20处采集视网膜，切片，并用抗视紫红质抗体（红色）和DAPI（蓝色）染色。(F类和*G公司*)使用Nrl启动子-Cre在杆状光感受器中错误表达Rax和Hes1。CALNL-最大(F类)或CALNL-Hes1(*G公司*)与Nrl启动子-Cre、CALNL-DsRed和CAG-GFP共同电穿孔到P0大鼠视网膜。四种质粒以2:1:2:3的质量比混合（最终浓度为6.5μg/μl）。在P20时采集视网膜，切片，并用DAPI（蓝色）染色。

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