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.2006年11月；4（12）：e423。
doi:10.1371/journal.pbio.0040423。

在未折叠的蛋白质反应过程中，自噬平衡内质网扩张

塞巴斯蒂安·贝纳莱斯 1, 肯特·麦克唐纳, 彼得·沃尔特
附属公司

在未折叠蛋白反应期间，自噬平衡内质网扩张

塞巴斯蒂安·贝纳莱斯等。 公共科学图书馆生物. 2006年11月.

摘要

内质网（ER）的蛋白质折叠能力由未折叠蛋白反应（UPR）调节。UPR感知内质网管腔中未折叠的蛋白质，并将信息传递到细胞核，在细胞核中驱动转录程序，该程序专门用于重建稳态。利用薄片电子显微镜，我们发现在UPR诱导条件下，酵母细胞的内质网体积至少扩大了5倍。令人惊讶的是，我们发现内质网增殖伴随着自噬体样结构的形成，自噬体样结构密集且选择性地被UPR-扩张内质网衍生的膜堆包裹。类似于嗜酸和有丝分裂，这是选择性地隔离和降解过氧化物酶体和线粒体的自噬过程，所描述的内质网特异性自噬过程利用了几个自噬基因：它们由UPR诱导，对内质网应激细胞的生存至关重要。有趣的是，细胞存活不需要空泡蛋白酶，这表明内质网隔离到自噬体样结构中，而不是降解，是重要的一步。选择性内质网隔离可以帮助细胞保持内质网丰度的新稳定水平，即使面对未折叠蛋白的不断积累。

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相互竞争的利益。提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。UPR诱导条件下内质网增殖
（A） 对照细胞和UPR诱导细胞内质网丰度的测定。显示了具有代表性的单元格。通过添加DTT在野生型细胞中诱导UPR。使用ImageJ分析对照细胞和UPR诱导细胞的超微结构。下图显示皮层ER（以品红色表示）和核膜（NE，以蓝色表示）的痕迹。液泡、细胞核和线粒体分别表示为V、N和M。（B） UPR期间内质网增殖的量化。诱导UPR，并在指定的时间点收集细胞进行EM。ER的长度（如[A]中所示）被测量并除以截面面积。数据是相对于时间0绘制的。每个时间点的测量值对应于25个独立细胞图像的平均值。（C） 的表达式HAC1类我通过添加100μM DOC诱导3小时。ER按上文（B）所述进行量化。
图2
图2。UPR期间内质网的形态变化
（A） 对照细胞和UPR诱导的细胞用于分析单个细胞内的内质网，并使用EM跟踪内质网。方框表示（B）中放大的区域。此处显示的单元格对应于（B）中标记为“+140 nm”的图像的整个部分。（B） 对照细胞和UPR诱导细胞的连续切片。各部分在z（z）-轴。ER用洋红表示，NE用蓝色表示。（C） 对照细胞和UPR诱导细胞的电镜照片显示，在UPR期间内质网膜之间的距离增加。为了更好地保存超微结构，本实验的样品采用高压冷冻/冷冻替代技术制备（见材料和方法）。
图3
图3。普遍定期审议期间含有内质网的自噬体（ERAs）的特征
（A） 含有ERA的典型DTT处理野生型细胞的图像。细胞核和细胞质分别表示为N和C。（B） 来自不同细胞的ERA的代表性图像的放大。右下角的图像可能显示了一个通过杯状ERA的部分。请注意，堆叠水池和封套之间没有连接。（C） ERA双层膜的高倍放大。（D） 发现一些ERA附着在ER管/板上或靠近ER管/板材（箭头所示）。请注意，（A）中的部分包括两个此类交叉点。（E） 与内质网小管/片材相连的ERA的高压冷冻/冷冻替代图像。该技术中使用的锇/铅染色显示了核糖体，并表明ERA外包膜（而非堆积的内池）紧密镶嵌着核糖体。这表明核糖体起源于ER膜。（F） 使用改进的协议可视化膜的ER-ERA接头的高压冷冻/冷冻替代图像。（G） 使用与（F）中相同的技术，我们可视化了ERA的内膜含量。请注意，内膜和隔离双膜包膜的两部分都含有结合核糖体，因此可能来自内质网。
图4
图4。UPR诱导后ER标记的荧光可视化
（A） 使用转座子组分Sec61和红色荧光蛋白“cherry”之间的融合蛋白对使用UPR诱导药物DTT（+DTT）或不使用药物处理的细胞进行可视化。顶部面板显示未处理的细胞，底部面板显示代表性的UPR诱导细胞。（B） 显示含有ERA的UPR诱导细胞的代表性图像（用箭头表示）。
图5
图5。用针对ER膜标记物的抗体对ERA进行免疫金标记
（A） 针对myc标记的Sec63（一种完整的内质网膜蛋白）进行免疫标记的细胞的代表性部分。作为一级抗体，我们使用了兔多克隆抗myc抗体，作为二级抗体，使用了15纳米金颗粒-结合抗兔抗体。细胞核、核膜、ER和ERA分别表示为N、NE、ER和ER。（B） 高倍电子显微镜下的内质网部分。定量分析表明，每线性微米内质网中有5±2个金颗粒。（C）高倍电子内质网。为了预测在一个特定的ERA中应该预计有多少金粒子，我们首先计算并平均ERA中的ER量（以线性微米表示的长度）（类似于图3B中所示的值），并将其面积的值标准化。这些计算确定每μm有20.8±3.3μm的ER2在ERA内部。这些值使我们能够预测如果ERA中填充了ER膜，那么在ERA的一段中预计会有多少金粒子。显示了两个具有代表性的ERA。中间图片中显示的ERA内部应含有2.4μm的ER，因此应含有12个金颗粒。我们数了12个金粒子。右侧的ERA可能包含2.7μm的ER，并且应该包含14个金颗粒；我们数了16个金粒子。右图显示了核质区的代表性视图。（D） 量化每个区域的金色标签密度。为了评估我们的免疫金标记程序的信噪比，我们通过计数核质（N）区域和ERA上的金颗粒数量来评估背景标记，并将计数标准化为相应的区域。
图6
图6。自噬标记GFP-Atg8的UPR诱导
（A） 用含有GFP-Atg8的质粒转化的野生型细胞在不含药物的合成培养基中、在UPR诱导条件下（+DTT和+TM）或在氮饥饿条件下（N饥饿）生长4小时，然后收获用于蛋白质制备。蛋白质提取物采用抗GFP抗体（顶面板）或抗Hac1抗体（底面板）进行蛋白质印迹分析。用BCA蛋白测定法测定总蛋白浓度。在每条通道中装载相同浓度的蛋白质，并通过Ponceau染色检查转移效率。指出了不同波段的特性。（B） 通过荧光显微镜观察在上述条件下生长的表达GFP-Atg8的野生型细胞。（C） 未经处理的提取物中检测到GFP-Atg8hac1Δ细胞或表达HAC1型我（+DOC）使用抗GFP抗体进行Western blotting。（D） 使用抗GFP抗体的提取物的Western blothac1Δ，ire1Δ，或vps4Δpep4Δ表达GFP-Atg8的细胞。突变细胞在常规条件、UPR诱导条件（+DTT）或氮饥饿条件（N饥饿）下生长。
图7
图7。未折叠蛋白反应诱导过程中GFP-Atg8的定位
使用荧光显微镜观察图4B中显示的一些DTT处理的表达GFP-Atg8和Sec61-cherry的细胞（作为ER标记）。GFP-Atg8定位于ER标记检测到的ERA附近。
图8
图8。Atg8和其他自动液位计UPR诱导过程中需要基因
野生型系列稀释液，hac1Δ、atg1Δ和atg8Δ、at g9Δ和at g16Δ，和atg20Δ删除单元格和vps4Δpep4Δ双缺失细胞生长在无药物（YPD）或不同浓度的衣霉素（TM；0.2或1.0μg/ml）的富中膜板上。atg19Δ给出了与此处显示的其他自噬基因相同的结果（未发表的数据）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 含有未折叠蛋白质的损伤。
    总L。 总L。 《公共科学图书馆·生物》。2006年12月；4（12）：e442。doi:10.1371/journal.pbio.0040442。Epub 2006年11月28日。 《公共科学图书馆·生物》。2006 PMID：20076517 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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