Mechanisms of regulation of CXCR4/SDF-1 (CXCL12)-dependent migration and homing in multiple myeloma

doi:10.1182/blood-2006-07-035857

.2007年4月1日；109(7):2708-17.

doi:10.1182/bloud-2006-07-035857。

多发性骨髓瘤中CXCR4/SDF-1（CXCL12）依赖性迁移和归巢的调控机制

附属公司

PMID： 17119115
预防性维修识别码：项目经理1852222
内政部： 10.1182/血液-2006-07-035857

多发性骨髓瘤中CXCR4/SDF-1（CXCL12）依赖性迁移和归巢的调控机制

亚赞·阿尔萨耶德等。血液. 2007.

.2007年4月1日；109(7):2708-17.

doi:10.1182/bloud-2006-07-035857。

附属

¹匹兹堡大学癌症研究所，血液学/肿瘤学部，内科，匹兹堡州立大学，宾夕法尼亚州。

PMID： 17119115
预防性维修识别码：项目经理1852222
内政部： 10.1182/血液-2006-07-035857

摘要

多发性骨髓瘤（MM）细胞迁移并回到骨髓的机制尚不清楚。在本研究中，我们试图确定趋化因子SDF-1（CXCL12）及其受体CXCR4对MM细胞迁移和归巢的影响。我们证明CXCR4在外周血中的高水平表达存在差异，并且在骨髓中表达下调，以应对高水平的SDF-1。共聚焦显微镜证实SDF-1诱导MM细胞运动、内化和细胞骨架重排。特异性CXCR4抑制剂AMD3100和抗CXCR4抗体MAB171在体外抑制MM细胞的迁移。CXCR4敲除实验表明，SDF-1依赖性迁移受P13K和ERK/MAPK途径调节，但不受p38 MAPK调节。此外，我们使用体内流式细胞术、体内共焦显微镜和全身生物发光成像证明AMD3100抑制MM细胞归巢至骨髓龛。因此，本研究表明，SDF-1/CXCR4是MM归巢的关键调节因子，并为该途径的抑制剂提供了框架，可用于未来的临床试验，以消除MM贩运。

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数字

图1
**多发性骨髓瘤患者中CXCR4和SDF1的表达。**（A） CXCR4在MM患者外周血（PB）和骨髓（BM）浆细胞上的表面表达。PB浆细胞中CXCR4的中位表达百分比为60%（范围为9%～96%），而活动性MM患者BM中的表达百分比为26.4%（范围为1%～81%）(*P（P）*= .001). （B）在7个匹配样本的PB和BM中，CXCR4在浆细胞上的细胞内表达。与BM样本相比，所有PB样本的细胞内表达显著更高，PB浆细胞的中位表达百分比为31.6%（范围，12%-71%），而BM浆细胞的中位表达百分比为5%（范围，0%-13.6%）(*P（P）*= .001). （C）用ELISA测定SDF-1的表达。与健康对照组（CTRL-BM，平均值2632 pg/mL）相比，MM患者BM中SDF-1水平显著升高（MM-BM；平均值6571 pg/mL(*P（P）*< .001). 此外，骨髓中的SDF-1水平与骨髓中SDF-1的水平相比，MM患者和健康对照组（MM-PB和CTRL-PB，分别为2382.46 pg/mL）的PB显著升高；*P（P）*= .001). 误差线代表标准偏差；星号，具有统计学意义。

图2
**YFP-CXCR4针对SDF-1进行本地化。**（A）用固定细胞法测定MM.1S细胞表面YFP-CXCR4的表达。（B） CXCR4受体内化对SDF-1（30 nM）刺激1小时的反应。（C）三维重建的活细胞方法显示CXCR4细胞骨架重排、加盖和假足形成对SDF-1的反应。

图3
**SDF-1引起的迁移和运动。**（A）血浆细胞对SDF-1的反应增强，形成假足。（B） Transwell迁移实验证明MM.1S和U266 MM细胞系对系列浓度的SDF-1（0-100 nM）的迁移反应。SDF-1在20至30 nM剂量下诱导最大迁移，在75至100 nM剂量时减少迁移。（C）跨阱迁移实验证明CD138的迁移⁺原代浆细胞对SDF-1的反应。

图4
**CXCR4信号通路抑制剂对迁移的调节。**（A）使用CXCR4抑制剂AMD3100（0-100μM）进行迁移分析。与对照组相比，AMD3100（10μM）诱导了70%的迁移抑制(*P（P）*= .03). 所有油井的下室中均含有20 nM SDF-1。（B）使用抗CXCR4抗体MAB171进行迁移分析。系列浓度的MAB171（0-400μg/mL）以剂量依赖的方式抑制迁移。与对照组相比，抗CXCR4 MAB171（10μM）将迁移抑制至53%，抗CXCR4 MAB171（200μM）将迁移抑制至35%(*P（P）*= .007). 在对照孔中使用IgG对照抗体（400μg/mL）。（C）模拟MM.1S和感染CXCR4 shRNA的MM.1S的跨阱迁移分析(*CXCR4型*敲低细胞）。*CXCR4型*敲除细胞仅迁移至对照组的43%，与未接触SDF-1的细胞相似（即，与使用SDF-1处理的对照模拟细胞相比，迁移减少60%）。对照组为SDF-1处理的模拟细胞。（D）在存在或不存在抗CXCR4抗体MAB171（200μg/mL）的情况下，对MM.1S进行跨阱迁移分析。将SDF-1（30 nM）放置在控制井的下室中。将MM患者（2名患者）的骨髓上清液放置在其他微孔的下腔中。BM上清液条代表MM.1S与对照组相比的平均迁移百分比。与对照组相比，MM.1S迁移是对BM上清液的反应（75.6%）。MAB171在SDF-1培养箱中抑制了36%的迁移，在含有BM上清液的培养箱中则抑制了52.5%的迁移。（E）使用用连续浓度的AMD3100处理的MM细胞系进行MTT生长抑制测定。与对照组相比，AMD3100没有抑制存活。（F）经CXCR4下游通路抑制剂处理的MM.1S中的迁移分析：PTX、LY294002、雷帕霉素、PD098059、LY 294002和PD098055组合以及p38 MAPK抑制剂SB203580。SDF-1（30 nM）放置在较低的腔室中。在30 nM SDF-1存在的情况下，与对照组相比，PTX（50 ng/mL）显著抑制了30%的迁移(*P（P）*= .004). PI3K抑制剂LY294002和MEK抑制剂PD098059分别抑制了57%和58%的迁移。PI3K下游的雷帕霉素显示出与LY294002相似的结果。PI3K和ERK/MAPK抑制剂的组合不是加性的（59%），表明两者通过相同的途径传递信号。p38 MAPK抑制剂SB203580（SB）对SDF-1没有抑制迁移。

图5
**MM中SDF1/CXCR4调节的信号通路。**（A） pERK和pAKT的免疫印迹显示，在1、3和5分钟时，SDF-1 30 nM以时间依赖的方式快速激活。（B）总CXCR4的免疫印迹显示，即使存在SDF-1刺激，SDF-1也能上调CXCR4（5分钟孵育时为30和100 nM），AMD3100也能抑制CXCR4。（C） pPI3K（p85）的免疫印迹显示对SDF-1的激活呈剂量依赖性，在100 nM下5分钟时达到最大激活。AMD3100（16小时孵育30-100μM）消除了这种效应，证实SDF-1通过CXCR4激活PI3K。（D）在有无AMD3100（30μM，16小时培养）的情况下，对PKC、pAKT和pERK1/2进行免疫印迹。SDF-1在1分钟和5分钟时导致pPKC、pAKT和pERK1/2快速上调。AMD3100抑制pPKC、pAKT和pERK1/2的表达。（E）免疫印迹*CXCR4型*击倒MM.1S（3-4道）和模拟感染MM.1S，使用或不使用30 nM SDF-1刺激1分钟。*CXCR4型*shRNA敲除导致CXCR4、p-PDK-1、pAKT和pERK1/2受到抑制，但对p-p38 MAPK没有抑制作用。（F）在50 ng/mL百日咳毒素（PTX）存在下对pERK和pAKT进行免疫印迹90分钟。SDF-1（30nM）诱导pERK和pAKT作为泳道1中的对照。即使存在SDF-1，PTX也抑制pERK和pAKT，表明SDF-1激活这些通路是Gi依赖性的。（G）在含有或不含SDF-1的PI3K抑制剂LY294002（25μM，20分钟）或MEK抑制剂PD098059（25μM，90分钟）的情况下，对pAKT和pERK进行免疫印迹。即使存在SDF-1，LY294002也抑制pAKT，而PD294002不影响AKT活性。LY294002抑制pERK1/2，表明ERK/MAPK位于PI3K的下游。即使存在SDF-1，PD294002也抑制pERK活性。

图6
**在AMD3100存在或不存在的情况下，MM.1S的体内流式细胞术和共焦显微镜成像。**（A）体内共焦流式细胞术。在2只BALB/c小鼠的尾静脉中注射DiD标记的细胞（用50μM AMD3100处理2小时或未经处理的对照）。每5分钟计数一次细胞，持续1小时。对照组和AMD3100治疗组小鼠的细胞计数分别减少86%和47%(*P（P）*= .002). （B）小鼠颅骨4个象限的体内共焦成像显示，矢状窦两侧（每张图片的中心）都有BM龛。未经治疗的对照小鼠中位于矢状窦旁血管段的荧光细胞；AMD3100处理的小鼠体内归宿于BM的细胞数量显著降低。（C）在未经治疗（CTRL）和经治疗的AMD3100小鼠的3个实验中，位于3区和4区BM生态位的荧光细胞的平均细胞数。与对照组相比，AMD3100治疗组小鼠的细胞计数下降至38%(*P（P）*= .01).

图7
**Luc的生物发光成像⁺将MM.1S细胞静脉注射到SCID/NOD小鼠的尾静脉中。**在注入50μM AMD3100或37°C的对照PBS中之前，在体外培养细胞4小时。注射后每隔5分钟进行一次全身实时生物发光成像，持续90分钟。（A）注射5分钟后，对照组（CTRL）和治疗组（AMD3100）小鼠的生物发光均匀分布。（B）注射30分钟后，心肺区域的荧光强度减弱，表明CTRL小鼠的循环退出。在AMD3100治疗的小鼠中，心肺区域的生物发光仍然很高。

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