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.2007年4月；19(4):761-71.
doi:10.1016/j.cellsig.2006.10.001。 Epub 2006年11月17日。

通过转化生长因子-beta1联合激活FAK和AKT使肌成纤维细胞具有抗失巢凋亡表型

杰弗里·霍洛维茨 1, 大卫·S·罗杰斯, 维沙尔·夏尔马, Ragini Vittal公司, 埃里克·S·怀特, 崔宗斌, 维克托·桑尼科尔
附属公司

通过转化生长因子-beta1联合激活FAK和AKT使肌成纤维细胞具有抗失巢凋亡表型

杰弗里·霍洛维茨等人。 单元格信号. 2007年4月.

摘要

转化生长因子β（TGF-β）是一种典型的肿瘤抑制细胞因子，对大多数靶细胞具有细胞抑制和促凋亡作用；然而，其在某些细胞类型和环境中的促生存/抗凋亡信号机制尚不清楚。已知TGF-β1在人肺成纤维细胞中诱导肌成纤维细胞分化，并与黏着斑激酶（FAK）和蛋白激酶B（PKB/AKT）的延迟激活有关。在这里，我们证明FAK和AKT分别由SMAD3和p38 MAPK的早期激活独立调节。破坏SMAD3信号传导阻断TGF-β1诱导的FAK激活而非AKT激活的药理学或遗传学方法；相反，早期p38 MAPK信号传导的中断会消除AKT激活，但不会改变FAK激活。TGF-β1能够在表达突变FAK的细胞中或在用含有RGD的肽处理的细胞中激活AKT，该肽干扰整合素信号传导，抑制FAK激活并诱导失巢（由粘附信号传导损失诱导的细胞凋亡）。TGF-β1部分通过激活PI3K-AKT途径保护肌成纤维细胞免受失巢。因此，TGF-β1协同且独立地激活FAK和AKT蛋白激酶途径，赋予肌成纤维细胞抗失巢凋亡表型。肌成纤维细胞中这些促生存/抗失巢凋亡途径的激活可能有助于TGF-β1在组织纤维化和肿瘤增殖中发挥重要作用。

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数字

图1
图1
SMAD3磷酸化的药理抑制阻断了TGF-β1诱导的FAK而非AKT的激活。（A） 在存在或不存在TGF-βR1（ALK5）抑制剂SB431542浓度增加的情况下，使用/不使用TGF-？1（2 ng/ml）处理静态IMR-90细胞。45分钟后收集细胞裂解物，通过SDS-PAGE进行评估，然后进行磷酸-SMAD3和磷酸-p38 MAPK的免疫印迹。然后对印迹进行条带化，并分别探测总SMAD3和p38 MAPK。（B） 在没有和存在指示浓度的SB431542的情况下，测定TGF-β1刺激的磷酸-SMAD3和磷酸-p38 MAPK的带密度。在没有抑制剂的情况下，TGF-β1刺激的磷酸化-SMAD3和磷酸化-p38 MAPK的带密度被标准化为100%，并且在指示浓度的SB431542存在下，各自蛋白质的带密度计算为“TGF-α1刺激的%”并相对于SB431542的浓度以非线性标度绘制。数值为平均值±SEM；n个=3个独立实验。（C） 在SB431542（1.0μM）存在/不存在的情况下，使用/不使用TGF-β1处理静态IMR-90细胞。16小时后收集细胞裂解物并评估Y397-磷酸化FAK和S473-通过SDS-PAGE和免疫印迹法磷酸化AKT。剥离印迹并分别探测总FAK和总AKT。结果代表了三个单独的实验。
图2
图2
SMAD3的siRNA敲除阻断TGF-β1诱导的FAK激活，但不抑制AKT的诱导激活。（A） 用靶向SMAD3（SMAD3 siRNA）或非靶向siRNA（对照siRNA）转染IMR-90成纤维细胞。转染48小时后，用TGF-β1（2 ng/ml）处理细胞45分钟或16小时（不含血清）。收集细胞裂解物并进行SDS-PAGE和western免疫印迹。在45分钟时获得的样本评估磷酸化SMAD3和p38 MAPK的早期信号事件，然后剥离并探测总SMAD3与p38 MAPK，然后检测GAPDH。在TGF-β1治疗后16小时获得的样本进行S473-磷酸化AKT，T308-磷酸化AKT和Y397-磷酸化FAK，然后剥离并探测相应的总蛋白表达。（B） 如“材料和方法”所述，测定（A）中蛋白质印迹的带密度，并计算Y的磷酸蛋白与总蛋白比率397phospho-FAK（开杆），S473phospho-AKT（封闭栅）和T308phospho-AKT（交叉钢筋）。数值为平均值±SEM；n个=3个独立实验。
图3
图3
TGF-β1激活FAK与p38 MAPK无关。（A） 在p38 MAPK抑制剂SB203580（6μM）存在/不存在的情况下，用TGF-β1（2 ng/ml）处理静态IMR-90细胞。对16小时后收集的细胞裂解液进行Y评估397-通过SDS-PAGE和western免疫印迹对FAK进行磷酸化。去除斑点并探测总FAK。（B） 用显性阴性、激酶突变的p38 MAPK（p38-KM）或空载体对照（pcDNA）稳定转染IMR-90成纤维细胞，并用TGF-β1（2 ng/ml）处理16 h。用western免疫印迹法检测全细胞裂解物的Y397-磷酸化FAK。剥离膜并吸干总FAK。
图4
图4
TGF-β1激活AKT与FAK信号无关。（A） 稳定过度表达显性阴性突变FAK（Y）的IMR-90细胞397用或不用TGF-β1（2 ng/ml）处理F-FAK）或空载体对照（pcDNA）16 h397-磷酸化FAK或S473-用免疫印迹法磷酸化AKT。剥离印迹物并用印迹法检测相应的总蛋白，然后检测β-肌动蛋白，以确认负载量相等。显示了三个独立实验的代表性印迹。（B） 进行密度分析，以确定与空载体对照中每个磷酸激酶表达相关的磷酸-FAK（开条）和磷酸-AKT（闭条）的变化。数据表示来自五个独立实验的相对密度变化，并通过ANOVA和Bonferroni后验进行分析。*第页与未经治疗的对照组相比，<0.01。（C） 在含有或不含有RGD氨基酸序列（GRGD公司S、 0.5毫克/毫升）。用SDS-PAGE和免疫印迹法分析全细胞裂解物的Y397-磷酸化FAK或S473-磷酸化AKT。去除印迹并探测相应的总蛋白。显示了五个独立实验的代表性印迹。（D） 如上文（B）所述，对（C）中斑点的相对密度测定进行分析。计算未经治疗对照组中磷酸-FAK（开杆）和磷酸-AKT（闭杆）相对于各自磷酸激酶表达的变化。* 第页与未经治疗的对照组中相应磷酸激酶的表达相比，<0.01。
图5
图5
IMR-90成纤维细胞失巢凋亡的诱导。静态IMR-90成纤维细胞在“材料和方法”中所述的指定时间段内保持悬浮。在悬浮期结束时，将细胞：（A）等分到96孔板中，用ELISA分析细胞凋亡不锈钢DNA；或者，（B）允许重新粘附在组织培养皿上3小时，并通过Coulter计数评估粘附细胞的数量。数值为平均值±SEM；n个=每个时间点3。* 第页与对照组相比<0.001#第页与1小时相比<0.001，** 第页<0.001 vs.2 h。（C）用可溶性RGD肽（GRGD公司S、 0.125 mg/ml或0.5 mg/ml）或不含RGD的肽（G无线电频率SP，0.5 mg/ml）24小时，并在光学显微镜下拍照。（D） 静态IMR-90成纤维细胞按照（C）中的方法处理，并按照材料和方法中的描述在24小时时评估细胞活力。数值为平均值±SEM；n个每种条件=6，实验一式三份。* 第页与对照组相比<0.05。（E） 用含有RGD的可溶性纤维连接蛋白肽（GRGD公司S、 0.125 mg/ml或0.5 mg/ml），持续24 h。收集全细胞裂解物，并按照“材料和方法”中所述分析等量蛋白质的caspase-3活性。数值为平均值±SEM；n个=每种条件3次，实验重复3次，结果相似。* 第页与对照组相比<0.01。
图6
图6
肌成纤维细胞受到含有RGD的可溶性肽诱导的失巢凋亡的保护。（A） 将静止的IMR-90成纤维细胞经±TGF-β1（2 ng/ml）处理16 h。然后将培养基改为含有0.01%FBS（含0、0.125或0.5 mg/ml可溶性RGD肽）的DMEM培养24 h，并用ELISA检测细胞凋亡不锈钢DNA。数值为平均值±SEM；n个=每种条件4次，实验重复3次，结果相似。* 第页与未经治疗的对照组相比<0.001。** 第页<0.01与0.5 mg/ml G相比RGD公司不含TGF-β1的S处理。（B） 用磷脂酰丝氨酸免疫荧光染色（FITC，绿色染色）检测细胞凋亡。通过检测三个不同盘子中每个盘子的3个随机高功率场来确定细胞凋亡的定量。%凋亡代表FITC的总数+单元格除以DAPI总数+细胞。结果代表了三个具有类似结果的独立实验。数值为平均值±SEM；* 第页与未经治疗的对照组相比，<0.05。** 第页<0.01与0.5 mg/ml G相比RGD公司不含转化生长因子-β1的S治疗。（C） 显示了（B）中一个高功率研究领域的代表性照片。用DAPI进行核复染。（D） 用TGF-β1处理IMR-90成纤维细胞16 h，然后用/不用含有RGD（0.5 mg/ml）的可溶性肽处理24 h。收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE和免疫印迹以检测活化（裂解）caspase-3。然后剥离印迹并探测GAPDH。
图7
图7
肌成纤维细胞活性和抗失巢凋亡依赖于PI3K-AKT。（A） 在用含有RGD的可溶性肽（GRGD公司S、 0.5 mg/ml），持续24小时，并按照“材料和方法”中的描述评估生存能力。数值为平均值±SEM；n个＝3，并且重复实验3次，得到类似的结果。* 第页与未经治疗的对照组相比，<0.01。** 第页与G相比<0.001RGD公司S仅0.5 mg/ml#=与0.5 mg/ml G相比不显著RGD公司只有S。（B） IMR-90细胞在96孔培养板中培养，在添加含有可溶性RGD的纤维连接蛋白肽（GRGD公司S 0.5 mg/ml）持续24 h。用ELISA评估细胞凋亡不锈钢DNA。数值为平均值±SEM；n个=每种条件4次，实验重复三次，结果相似。* 第页与未经治疗的对照组相比，<0.05。** 第页<0.05与0.5 mg/ml G相比RGD公司S单独治疗#=与0.5 mg/ml G相比不显著RGD公司只有S。
图8
图8
TGF-β1诱导抗失巢凋亡肌成纤维细胞中FAK和AKT活化的组合信号传递模型。TGF-β1通过p38 MAPK依赖性、SMAD3非依赖性机制激活PKB/AKT；而在人肺成纤维细胞中，FAK的激活是通过SMAD3依赖性、p38 MAPK非依赖性途径介导的。这些通路的激活与诱导肌成纤维细胞分化和获得抗失巢凋亡表型同时发生。TGF-β1对PI3K-AKT通路的诱导激活有助于肌成纤维细胞抗失巢凋亡。
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