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.2007年1月；81(2):548-57.
doi:10.1128/JVI.01782-06。 Epub 2006年11月15日。

严重急性呼吸综合征冠状病毒开放阅读框（ORF）3b、ORF 6和核衣壳蛋白作为干扰素拮抗剂发挥作用

莎拉·科佩奇·布隆伯格 1, 路易斯·马丁内斯·索布里多, 马修·弗里曼, 拉尔夫·巴里克, 帕雷斯
附属公司

严重急性呼吸综合征冠状病毒开放阅读框（ORF）3b、ORF 6和核衣壳蛋白作为干扰素拮抗剂发挥作用

莎拉·科佩奇·布隆伯格等。 J维罗尔. 2007年1月.

摘要

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（严重急性呼吸系统综合征冠状病毒）在人类中具有高致病性，死亡率接近10%。这种高致病性表明SARS-CoV已发展出克服宿主先天免疫反应的机制。现已确定SARS-CoV开放阅读框（ORF）3b、ORF 6和N蛋白可对抗干扰素，干扰素是先天免疫反应的关键成分。所有三种蛋白都抑制了β-干扰素（IFN-beta）的表达，进一步的检测表明，这些SARS-CoV蛋白抑制了IFN-beta-IRF-3表达所必需的关键蛋白。N蛋白显著抑制NF-kappaB应答启动子的表达。仙台病毒感染后，所有三种蛋白都能够抑制干扰素刺激反应元件（ISRE）启动子的表达，而干扰素治疗后，只有ORF3b和ORF6蛋白能够抑制ISRE启动子的表现。这表明N蛋白仅抑制干扰素的合成，而ORF3b和ORF6蛋白同时抑制干扰素的合成和信号传导。ORF 6蛋白（而非ORF 3b或N蛋白）抑制STAT1的核转位，但不抑制其磷酸化。因此，这三种SARS-CoV干扰素拮抗剂似乎通过不同的机制抑制干扰素反应。

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数字

图1。
图1。
SARS-CoV ORF3b、ORF6和N蛋白作为潜在干扰素拮抗剂的鉴定。A.用对照质粒或表达HA标记SARS-CoV蛋白的质粒转染A549细胞。在转染后24小时，细胞被NDV-GFP感染，该病毒在干扰素拮抗剂存在下生长。使用10倍物镜在感染后24小时获得图像，这些图像代表了三个实验。用表达HA标记的SARS-CoV蛋白的质粒转染A549细胞24小时，固定，并使用HA标记抗体分析SARS-CoV蛋白的表达。
图2。
图2。
SARS-CoV ORF3b、ORF6和N蛋白的定位和凋亡分析。用表达GFP标记的ORF3b（A）、ORF6（B）或N（C）蛋白的质粒转染293T细胞24小时。细胞固定、渗透并用BODIPY TR染色高尔基体，用PDI抗体染色ER，用细胞色素抗体染色线粒体c（c）或染色质使用DAPI染色。绿色代表GFP标记的蛋白质，红色代表指示的细胞器，蓝色代表染色质。使用63倍物镜通过共焦显微镜分析细胞，并显示代表性图像。将GFP或表达GFP标记的ORF 7a、ORF 3b、ORF 6或N蛋白的质粒转染D.293T细胞24 h。通过荧光和相控显微镜分析细胞与凋亡相关的形态学变化。转染E.293T细胞24小时，收获、裂解并分析caspase-3活性。
图3。
图3。
SARS-CoV ORF 3b、ORF 6和N蛋白抑制干扰素的产生。在IFN-β启动子和空载体质粒、表达流感病毒NS1的质粒或表达SARS-CoV蛋白的质粒的控制下，将表达红色荧光蛋白的质粒与A.293T细胞共转染。转染后24小时，细胞感染仙台病毒以刺激干扰素的产生。使用10倍物镜在感染后24小时拍摄图像。B.使用图像J软件对来自针对面板A描述的三个实验的图像进行定量。数据是三个实验的平均值加上标准偏差。C.用所示质粒转染细胞24小时，然后感染仙台病毒24小时。细胞固定、渗透，并使用仙台病毒单克隆抗体分析仙台病毒蛋白。
图4。
图4。
SARS-CoV ORF 3b、ORF 6和N蛋白抑制IRF-3的激活。A.293T细胞与p55-CIB启动子共转染，该启动子包含三个IRF-3结合位点，一个组成性表达的质粒雷尼利亚荧光素酶和表达SARS-CoV蛋白的质粒或指示的对照质粒。细胞在转染后24小时感染仙台病毒。在感染后24小时收集细胞并分析萤火虫和雷尼利亚荧光素酶。使用雷尼利亚荧光素酶值。数据是三个实验的平均值加上标准偏差。100%的值代表大约10000000个萤火虫荧光素酶单位（p55-CIB）和6000000个雷尼利亚荧光素酶单位。用所示质粒转染B.293T细胞并感染仙台病毒6 h。收集细胞，用磷酸化-IRF-3抗体通过Western blotting分析裂解产物。数量在每个带的下方给出，是空的感染控制值的百分比。将所示质粒转染C.293T细胞24小时，然后感染仙台病毒。细胞在感染后8小时固定，并使用识别HA标签的抗体进行显微镜分析。
图5：。
图5：。
N蛋白抑制NF-κB活化。293T细胞与表达萤火虫荧光素酶的质粒共转染，该质粒受包含两个NF-κB结合位点的NFκB应答启动子控制雷尼利亚荧光素酶质粒和指示质粒。转染后24小时，细胞感染仙台病毒。感染后24小时，收集细胞并分析萤火虫和雷尼利亚荧光素酶活性。将单元格归一化为雷尼利亚荧光素酶控制。数据是三个实验的平均值加上标准偏差。100%的值表示约8000000萤火虫萤光素酶单位和6000000雷尼利亚荧光素酶单位。这个P（P）N和ORF6蛋白的值小于0.05。
图6。
图6。
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒蛋白对含有ISRE的启动子的抑制作用。将293T细胞与ISRE-GFP和所示质粒共转染24 h。然后用仙台病毒（A和B）感染细胞或用干扰素-β（C和D）处理细胞24 h，然后用10倍显微镜进行分析。使用ImageJ软件（B和D）对图像进行量化。数据是三个实验的平均值加上标准偏差。
图7。
图7。
ORF 6蛋白抑制STAT1向细胞核的移位。用STAT1-GFP和所示质粒共同转染A和B.293T细胞。转染后24小时，用干扰素-β处理细胞1小时，然后固定并染色。用HA标签抗体观察病毒蛋白，用Hoechst 33342染色观察DNA。绿色代表STAT1-GFP，红色代表病毒蛋白，蓝色代表DNA。用共焦显微镜分析细胞，并显示典型图像。所有图像均使用63倍物镜获得；使用蔡司共焦软件放大面板B中的图像。
图8。
图8。
SARS-CoV蛋白对STAT1磷酸化的分析。将所示质粒转染A.293T细胞24小时，然后用IFN-β处理1小时。收集细胞，并使用识别磷酸化STAT1和总STAT1形式的抗体对裂解产物进行Western blot分析。B.用所示质粒和STAT-1 GFP转染细胞24小时，然后用干扰素-β处理1小时。细胞固定、渗透，并用共聚焦显微镜用10倍物镜分析磷酸-STAT1。显示了具有代表性的图像。
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参考文献

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