Modulation of the W748S mutation in DNA polymerase gamma by the E1143G polymorphismin mitochondrial disorders

doi:10.1093/hmg/ddl424

.2006年12月1日；15(23):3473-83.

doi:10.1093/hmg/ddl424。 Epub 2006年11月6日。

E1143G多态性蛋白线粒体疾病对DNA聚合酶γ中W748S突变的调控

雪琳·S·L·陈¹, 马修·J·朗利, 威廉·科普兰

附属公司

PMID： 17088268
预防性维修识别码：项目经理1780027
内政部： 10.1093毫克/天24

E1143G多态性蛋白线粒体疾病对DNA聚合酶γ中W748S突变的调控

雪琳·S·L·陈等。人类分子遗传学. 2006.

.2006年12月1日；15(23):3473-83.

doi:10.1093/hmg/ddl424。 Epub 2006年11月6日。

作者

雪琳·S·L·陈¹, 马修·J·朗利, 威廉·科普兰

附属

¹美国北卡罗来纳州三角研究园国立卫生研究院国家环境健康科学研究所分子遗传学实验室，邮编27709。

PMID： 17088268
预防性维修识别码：项目经理1780027
内政部： 10.1093/hmg/ddl424

摘要

DNA聚合酶γ（pol-gamma）是线粒体DNA复制和修复所必需的。编码pol-gamma催化亚单位的基因POLG中有80多个突变与疾病有关。POLG中的W748S突变是共济失调神经病变谱疾病中最常见的突变，通常在顺式中发现，具有常见的E1143G多态性。目前尚不清楚E1143G是否参与疾病过程。我们研究了含有W748S或E1143G或两者的pol-gamma蛋白的生化后果。W748S pol-gamma表现出低DNA聚合酶活性、低加工性和严重的DNA结合缺陷。然而，催化亚基和辅助亚基之间的相互作用是正常的。尽管与辅助亚单位结合有好处，但催化活性并未达到野生型（WT）水平。此外，与WT相比，核苷酸选择性降低了2.1倍。令人惊讶的是，仅含有E1143G的polγ的活性是WT的1.4倍，这种聚合酶活性的增加可能是由于E1143G polγ具有更高的热稳定性。E1143G替换部分缓解了W748S突变的有害影响，因为W748S-E1143G的DNA结合、催化活性和保真度是中间值。然而，W748S-E1143G的蛋白质折叠焓变化显著低于W748S单独折叠焓的变化。我们认为，当E1143G与其他致病突变呈顺式时，它可以调节这些突变的作用。对于W748S-E1143G pol-gamma，E1143G带来的好处包括增加DNA结合和聚合酶活性；然而，E1143G对蛋白质稳定性有些不利。

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数字

图1
人体polγ示意图。(A类)核酸外切酶结构域中的保守氨基酸基序I、II和III以及聚合酶结构域的基序A、B和C位于人polγ催化亚基的连接区两侧。中23个外显子的相对位置*POLG公司*与致病性W748S氨基酸替代在连接子区域内的位置以及聚合酶域内的E1143G多态性一起显示。(B类)跨物种保护W748和E1143氨基酸。

图2
WT和突变p140蛋白的CD光谱。将WT p140（红色方块）、W748S p140（蓝色三角形）、E1143G p140（绿色菱形）和W748S-E1143G p140（黄色圆圈）稀释至10μg/ml的蛋白质浓度，并按照材料和方法一节中的描述测量CD光谱。

图3
单引物M13 DNA上WT和突变p140蛋白的加工性。按照材料和方法一节所述进行底漆延伸反应。反应包含9.6 ng p55辅助亚单位（通道3、4、7、8、11、12、15、16）和12 ng WT p140 Exo⁻（1-4车道）、W748S p140（5-8车道）、E1143G p140（9-12车道）或W748S-E1143G p140（13-16车道）。在0 mM NaCl（奇数车道）或100 mM NaCl（偶数车道）下测量放射性。车道0没有酶。未过期的35mer引物的位置由箭头指示。标记表示延伸引物的总长度（nt）。

图4
副亚单位保护WT p140和突变p140免受NEM的抑制。使用poly（rA）.oligo（dT）进行聚合酶分析_{12 – 18}，如材料和方法部分所述（不包括2-巯基乙醇）。反应包含8 ng WT p140（正方形）、W748S p140（三角形）、E1143G p140（菱形）或W748S-E1143G p140（圆形）、6.3 ng p55（闭合符号）、75 mM NaCl和指示量的NEM。

图5
WT和E1143G p140具有相似的DNA结合能力，而W748S和W748S-E1143G p 140具有更低的DNA结合能力。*K（K）*_d（DNA）如材料和方法一节所述，通过电泳迁移率变化分析估算值。所有值均为两次独立测定的平均值。

图6
WT和突变p140蛋白二级结构的稳定性。按照材料和方法一节中的描述进行CD分析。(A类)WT和突变p140蛋白的热稳定性：WT p140（红色方块）、W748S p140（蓝色三角形）、E1143G p140（绿色菱形）和W748S-E1143G（橙色圆圈）。每个样品的蛋白质浓度为10μg/ml(B类)p140蛋白的熔化温度和焓变化。钻石代表每个p140蛋白的熔化温度。条形表示蛋白质折叠在220 nm处的焓变化。所有值均为3或4次独立测定的平均值。标准偏差用误差条表示。

图7
Glu1143在polγ聚合酶结构域同源模型中。注意E1143在β链（黄色）和α螺旋（红色）之间的转折处的位置。两种催化镁²⁺离子呈灰色，DNA引物模板显示为橙色/蓝色/绿色。Glu1143侧链位于活动站点中心的外部（已标记）。

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