S6K1 regulates GSK3 under conditions of mTOR-dependent feedback inhibition of Akt

doi:10.1016/j.molcel.2006.09.019

.2006年10月20日；24(2):185-97.

doi:10.1016/j.molcel.2006.09.019。

S6K1在mTOR依赖的Akt反馈抑制条件下调节GSK3

许海章¹, 亚历克斯·利波夫斯基, 克里斯蒂安·迪布尔, 考古学系教授沙辛, 布伦丹·D·曼宁

附属公司

PMID： 17052453
预防性维修识别码：项目经理1880887
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.molcel.2006.09.019

S6K1在mTOR依赖的Akt反馈抑制条件下调节GSK3

许海章等。分子电池. 2006.

.2006年10月20日；24(2):185-97.

doi:10.1016/j.molcel.2006.09.019。

作者

许海章¹, 亚历克斯·利波夫斯基, 克里斯蒂安·迪布尔, 考古学系教授沙辛, 布伦丹·D·曼宁

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院哈佛公共卫生学院遗传与复杂疾病系，邮编：02115。

PMID： 17052453
预防性维修识别码：项目经理1880887
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.molcel.2006.09.019

勘误表in

S6K1在mTOR依赖的Akt反馈抑制条件下调节GSK3。
Zhang HH、Lipovsky AI、Dibble CC、Sahin M、Manning BD。 Zhang HH等。分子细胞。2023年9月7日；83(17):3217. doi:10.1016/j.molcel.2023.08.003。分子细胞。2023 PMID：37683612 没有可用的摘要。

摘要

雷帕霉素复合物1（mTORC1）哺乳动物靶点对PI3K-Akt通路的反馈抑制已成为肿瘤综合征、癌症和胰岛素抵抗的重要信号事件。缺乏结节性硬化综合征（TSC）基因产物的细胞是这种反馈调节的模型。我们发现，尽管Akt减弱，但在缺乏TSC1或TSC2的细胞和肿瘤中，Akt底物GSK3被组成性磷酸化。在这些条件下，GSK3磷酸化对雷帕霉素或氨基酸提取对mTORC1的抑制敏感，并且GSK3成为S6K1的直接靶点。这种异常磷酸化导致GSK3活性降低和下游底物磷酸化，并有助于TSC缺陷细胞的生长因子依赖性增殖。我们发现，在HepG2细胞胰岛素抵抗模型中，GSK3也可以调节mTORC1下游。因此，我们定义了S6K1而非Akt是主要GSK3调节激酶的条件。

PubMed免责声明

数字

**图1。GSK3磷酸化在*Tsc2型*无细胞，在TSC肿瘤中升高**
（A） Akt底物FOXO3a和GSK3的差异调节*Tsc2−/−*MEF公司。轻量化衍生*Tsc2型^+/+*（+）和*Tsc2型^−/−*（−）MEF在无血清（−ser）或有血清（+ser）的情况下培养16小时，或血清饥饿后用50 ng/ml IGF1或5 ng/ml刺激15分钟*Tsc2型^+/−*老鼠。来自五种不同肿瘤的代表性示例*Tsc2+/-*放大200倍显示12个月大的小鼠；与相邻正常组织的插图显示为1000X。磷化氢GSK3为棕色；细胞核被复染成蓝色。（C）来自TSC患者的皮质块茎巨细胞中GSK3磷酸化升高。皮质结节切除的代表性巨细胞被波形蛋白（绿色）和磷酸化GSK3（红色）染色。棒材：20μM。

**图2。TSC1-2复合物的缺失导致GSK3的沃特曼抗性雷帕霉素敏感性磷酸化**
（A）轻量化衍生*Tsc1型^+/+*和*Tsc1型^−/−*将MEF血清饥饿16 h，然后用100 nM沃特曼（w）或20 nM雷帕霉素（r）预处理15 min，然后用25 ng/ml IGF1刺激15 min，如有指示。然后用指示的磷酸特异性抗体或总GSK3和eIF4E抗体对裂解产物进行免疫印迹，作为负荷对照。（B）按照A中所述处理细胞，但使用枯落物衍生的*Tsc2型^+/+*和*Tsc2型^−/−*MEF公司。（C） GSK3替代法规的救援*Tsc2型^−/−*带有野生型人类TSC2的MEF。逆转录病毒感染池*Tsc2型^−/−*稳定表达空载体、人TSC2或TSC2（P419S）患者衍生突变体的MEF按照a.（D）在HeLa细胞中的TSC2敲除导致组成性雷帕霉素敏感性GSK3磷酸化。在用对照或TSC2 siRNAs转染48小时后，HeLa细胞被血清饥饿16小时，并用20 nM雷帕霉素处理15分钟，如有指示。

**图3。mTORC1依赖的GSK3磷酸化*Tsc2型*空单元格**
（A） S6K1和GSK3磷酸化在*Tsc2型^−/−*细胞。*Tsc2型^+/+*和*Tsc2型^−/−*将MEF血清饥饿16 h，然后用20 nM雷帕霉素或增加剂量的沃特曼（50 nM至5μM）预处理15 min，然后用50 ng/ml IGF1刺激15 min。（B） GSK3的氨基酸依赖性磷酸化*Tsc2型^−/−*细胞。*Tsc2型^+/+*和*Tsc2型^−/−*将MEF的血清饥饿16小时，然后在用50 ng/ml IGF1刺激15分钟之前，将MEF放入含有或不含氨基酸的新鲜培养基中再培养2小时，如有指示。同时进行磷酸化、总Akt和GSK3的免疫印迹。（C） Akt和GSK3的生长因子反应性磷酸化被恢复到*Tsc2型^−/−*长期雷帕霉素处理后的细胞。*Tsc2型^−/−*MEF在用25 ng/ml IGF1刺激15分钟之前，在20 nM雷帕霉素的作用下，在规定的时间内，血清饥饿24小时。（D）长时间雷帕霉素可降低*Tsc2型^−/−*细胞。*Tsc2型^−/−*将MEF在20nM雷帕霉素存在下血清饥饿48小时，持续指定的持续时间。（E）长期雷帕霉素治疗使沃特曼敏感的GSK3磷酸化恢复到*Tsc2型^−/−*细胞。*Tsc2型^−/−*在有或无20 nM雷帕霉素的情况下，将MEF的血清饥饿24小时，用20 nM雷帕霉素或100 nM沃特曼肽（如有指示）预处理15分钟，然后用25 ng/ml IGF1刺激15分钟。

**图4。S6K1磷酸化TSC缺乏细胞中的GSK3**
（A） GSK3和S6K1底物eIF4B和S6上的相应磷酸化位点相似。对GSK3α-S21、GSK3β-S9、eIF4B-S422和核糖体S6-S236两侧的残基进行了比对。（B）缺乏血清的S6K1Tsc2型^−/−MEF（而非野生型MEF）可以磷酸化GSK3β-S9体外试验。Tsc2型^+/+和*Tsc2型^−/−*将MEF血清饥饿16小时，然后用20 nM雷帕霉素治疗15分钟，如有需要。免疫沉淀的S6K1用于*在体外*以细菌产生的GSK3β为底物的激酶测定。使用磷酸特异性抗体检测S9上的GSK3磷酸化。（C）来自用以下物质处理的血清饥饿HeLa细胞的S6K1TSC2系统siRNA可以磷酸化GSK3β-S9，但不能控制siRNA在体外.转染后24小时，与对照组或*TSC2系统*-针对siRNAs，HeLa细胞按照B（D）S6K1敲除中的描述进行处理*Tsc1型^−/−*细胞阻断GSK3的构成性磷酸化。用指定剂量的对照或S6K1靶向siRNA转染24小时后，*Tsc1型^−/−*MEF被血清饥饿16小时。（E）*Tsc2型^−/−*MEF按D所述进行处理。

**图5。GSK3活性在Tsc2阴性细胞中降低，并被雷帕霉素重新激活**
（A）血清缺乏时GSK3激酶活性较低*Tsc2型^−/−*并通过雷帕霉素处理激活。*Tsc2型^+/+*和*Tsc2型^−/−*将MEF血清饥饿16小时，然后用20 nM雷帕霉素（Rap）治疗30分钟，如有需要。免疫沉淀GSK3的活性是使用从糖原合成酶中提取的启动磷酸肽进行测定的。数据表示为相对于未处理野生型细胞的平均±SEM活性*1对3，*P（P）*<0.01; **3对4，*P（P）*<0.001. （B）糖原合成酶和c-Myc上GSK3位点的磷酸化在*Tsc2型^−/−*细胞和雷帕霉素修复。*Tsc2型^+/+*和*Tsc2型^−/−*将MEF的血清饥饿6小时，然后在需要的地方用Rap治疗30分钟。eIF4E的总级别作为加载控件提供。（C） GSK3依赖性糖原合成酶磷酸化的修复*Tsc2型^−/−*人类MEFTSC2系统.逆转录病毒感染池*Tsc2型^−/−*将MEF的血清饥饿4 h，并在需要时用10μM SB216763和/或Rap进行处理。肌动蛋白的总水平被提供作为负载控制。（D） c-Myc磷酸化和降解的补救*Tsc2型^−/−*人类MEFTSC2系统.两个独立样本，每个样本均为*Tsc2型^−/−*稳定表达空载体、人TSC2或TSC2患者衍生突变株（P419S）的MEF在裂解前血清饥饿4小时*表示B和D中的交叉反应带。

**图6。GSK3的异常调节有助于TSC缺陷细胞的无血清增殖特性**
（A）枯落物衍生的扩散*Tsc2型^+/+*（重量）和*Tsc2型^−/−*全血清（KO）MEF。细胞在含有新鲜营养素的10%胎牛血清中培养，每天提供的血清中含有0.1%二甲基亚砜（载体）或20 nM雷帕霉素（Rap）。数据以平均值±SEM表示。（B）细胞与A中一样培养，但在血清饥饿条件下培养。（C） GSK3的药理抑制部分阻断雷帕霉素对小鼠无血清增殖特性的影响*Tsc2型^−/−*细胞。*Tsc2型^−/−*在载体、Rap或Rap加10mM LiCl或10μM SB216763存在下，在无血清培养基中培养MEFs 48小时。在减去原始电镀细胞数后，数据以相对于载体控制的细胞平均±SEM百分比表示*Rap与Rap+LiCl或Rap+SB216763比较，P<0.05。（D）按照C中的描述培养细胞，但在最后24小时内添加BrdU。数据显示为DAPI染色细胞核（红色）的平均±SEM百分比，BrdU（黄色/绿色）也呈阳性*Rap与Rap+LiCl，*P（P）*<0.05. （E）细胞内GSK3α和β的SiRNA敲除*Tsc2型^−/−*MEF公司。（F） GSK3α和β的SiRNA敲除显著阻断雷帕霉素对*Tsc2型^−/−*细胞。转染对照或GSKα和β靶向siRNA 24小时后，相同数量的*Tsc2型^−/−*MEF在载体或Rap存在下重新接种，血清饥饿24小时。数据显示为C.**对照siRNAs+Rap与GSK3α/βsiRNAs+Rap，*P（P）*<0.001. （G） GSK3β-S9A可以抑制生长因子依赖性增殖*Tsc2型^−/−*细胞。逆转录病毒感染池*Tsc2型^−/−*稳定表达空载体（pBabe-puro）或pBabe-puro编码的MEFGSK3β-S9A或*TSC2系统*等量电镀，无血清培养48h。

**图7。细胞胰岛素抵抗条件下GSK3的mTORC1依赖性磷酸化**
（A）在胰岛素抵抗的HepG2细胞中，GSK3磷酸化对雷帕霉素敏感。如图所示，在缺乏或存在100 nM胰岛素的情况下，将HepG2细胞的血清饥饿16小时，并用20 nM雷帕霉素（R）或100 nM的胰岛素（I）治疗15分钟。（B）雷帕霉素增加胰岛素抵抗HepG2细胞中Akt磷酸化，但降低GSK3磷酸化。用100nM胰岛素处理细胞16小时，然后用20nM雷帕霉素处理15分钟。然后对每种条件下的三种独立裂解物进行免疫印迹，以检测磷酸化Akt-S473、总Akt、磷酸化GSK3α/β-S21/S9和总GSK3β，并使用红外成像系统对数据进行量化。数据表示为未处理样品和雷帕霉素处理样品之间磷酸蛋白与总蛋白的平均+/-SEM相对比率*p=0.0105**p=0.0001***p=0.0439（C）有丝分裂原刺激的PI3K-Akt通路（绿色）和营养敏感的mTOR-S6K1通路（蓝色）对GSK3的差异调节。

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