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.2006年10月；25(4):595-606.
doi:10.1016/j.immuni.2006.08.020。

CD44是巨噬细胞迁移抑制因子CD74受体复合物的信号成分

薛荣石 1, 林冷, 田旺, 王文奎, 新都, 季丽, 考特尼·麦克唐纳, 尊晨, 詹姆斯·墨菲, 埃利亚斯·洛利斯, 诺布尔, 沃伦·克努森, 理查德·布卡拉
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CD44是巨噬细胞迁移抑制因子CD74受体复合物的信号成分

薛荣石等。 免疫. 2006年10月.

摘要

巨噬细胞移动抑制因子（MIF）受体（CD74）最近被克隆，但其信号机制尚不清楚。我们假设信号传递需要额外的分子，如CD44，它激活非受体酪氨酸激酶。我们利用CD74和CD44缺陷的COS-7/M6细胞创建稳定的转染体，表达CD74、CD44和缺乏胞质内信号结构域的截断CD44。CD74单独介导的MIF结合；然而，MIF诱导的ERK1和ERK2激酶磷酸化需要全长CD44的共同表达。MIF结合与CD74和CD44的丝氨酸磷酸化有关。使用siRNA或激酶抑制剂的研究表明，MIF通过CD44诱导ERK1和ERK2活化需要Src酪氨酸激酶。对CD74、CD44和CD74-CD44转化子及其相应突变细胞的研究表明，CD74和CD44对于MIF防止凋亡是必要的。这些数据确定CD44是导致MIF信号转导的CD74受体复合物的一个组成部分。

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图1
图1
用于创建稳定细胞系IC、TM和EC的人类CD74和CD44蛋白质的结构示意图分别是细胞内、跨膜和细胞外结构域。指出了已知胞质内丝氨酸磷酸化位点的位置。
图2
图2
CD44、CD74、CD74+CD44或CD74+CD44稳定转染COS-7/M6细胞的分析Δ67（A） 用人CD44和人CD74抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。CD44无法与CD44区分Δ67翻译后糖基化导致的分子量（Jiang等人，2002）。（B） 表达CD44、CD74、CD74+CD44或CD74+CD44的COS-7/M6细胞对照或COS-7/M6细胞的细胞表面表达Δ675×10孵育后进行流式细胞术4在0°C下用FITC-标记的抗CD44或抗CD74细胞。每个分析都包括一个同型对照。（C） Alexa MIF与COS-7/M6细胞和用CD44、CD74或CD74+CD44稳定转染的COS-7/M6细胞结合的流式细胞术分析。每个面板显示5×10的荧光剖面4细胞在0°C下用Alexa-MIF培养30分钟。对照研究显示，未标记MIF（25倍过量）或抗CD74（克隆LN2，50μg/ml）对Alexa-MIF结合具有特异性竞争（Leng等人，2003年，未显示数据）。在所有图形标签中，COS-7细胞指CD74和CD44缺陷的COS-7/M6细胞系。数值显示MFI±SD（未配对t检验的p值）。
图3
图3
MIF诱导的ERK磷酸化需要CD74和全长完整的CD44（A）通过MIF刺激COS-7，CD74+CD44表达细胞系对ERK1和ERK2（ERK1/2）进行剂量依赖性磷酸化。（B） 稳定转染CD74、CD44、CD74+CD44或CD74+CD44的COS-7/M6细胞Δ67用MIF（100 ng/ml）刺激指定时间。（C） 野生型小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），而不是CD74-KO或CD44-KO小鼠，通过ERK磷酸化对MIF产生反应。（D） 预先形成的MIF/CD74复合物不会刺激CD44表达的COS-7/M6细胞中ERK磷酸化。将重组sCD74与MIF以3:1摩尔比孵育过夜，然后添加到细胞中10分钟。表皮生长因子（EGF）用作ERK磷酸化的阳性对照。（E） 稳定转染CD74+CD44、CD74或CD44的COS-7细胞与指定的细胞系伙伴（1×106和MIF诱导的ERK磷酸化。磷酸化蛋白与总激酶蛋白之间的数字比率通过三个实验的密度扫描确定，并表示为每条通道下方的折叠变化。通过Student t检验计算每个比较的p值（[A]中100、50和10对0 ng/ml MIF，[B]和[C]中100对0 ng/ml MIF。***p<0.01，**p<0.02，*p<0.05。不显示与p>0.05比较的p值）。KO，击倒。
图4
图4
用ELISA（A）COS-7/M6衍生细胞系和MEF测定CD74和CD44的磷酸含量，用MIF（100 ng/ml）处理10分钟，并用CD74特异性夹心ELISA分析细胞裂解物中的磷酸。（B） 在MIF（100 ng/ml）刺激之前，用蛋白激酶A（PKA）抑制剂H-89（20μM）或蛋白激酶C（PKC）抑制剂RO-31-28801（10μM）预处理COS-7/CD74+CD44细胞系30和60分钟。然后分析细胞裂解液中的磷-胺含量。（C） 用MIF（100 ng/ml）处理COS-7/M6衍生的细胞系和MEF 10 min，并用CD44特异性夹心ELISA分析细胞裂解物中的磷酸。（D） 与PKA抑制剂H-89或PKC抑制剂RO-31-2880预孵育30分钟后，分析对照细胞系和MIF刺激的COS-7细胞系中的CD44磷酸胺含量。磷酸胺含量表示为细胞治疗与非治疗的细胞裂解物ELISA的相对吸光度值*与相应的对照组相比，p<0.02。（E） MIF刺激10分钟后对COS-7–CD74+CD44细胞进行Western分析。用磷酸特异性和总PKA及PKC抗体检测细胞裂解物中的PKA和PKC，*p<0.01。KO，击倒。误差条表示平均值±SD。
图5
图5
Src酪氨酸激酶介导MIF诱导的ERK磷酸化（A和B）COS-7/M6衍生细胞系（A）或MEFs（B）用MIF刺激10分钟，并通过特定抗体分析细胞裂解物中的磷酸化Src（p-Src，Tyr416）、GAPDH、磷酸化ERK1和ERK2（p-ERK1/2），以及总ERK1与ERK2。（C） 表达CD74+CD44的COS-7/M6细胞，在用MIF刺激之前，用针对C-Src的siRNA或对照siRNA处理。通过western blotting分析裂解产物的p-Src、总Src，GAPDH和ERK。表达CD74+CD44（D）的（D和E）COS-7/M6细胞或野生型小鼠（E）的原代巨噬细胞在MIF刺激（10分钟）和western blotting之前用激酶抑制剂PP2处理60分钟。车道以下的密度值是指磷蛋白与总参考蛋白的比值，*p<0.05，**p<0.04，**p<0.01。
图6
图6
MIF介导的细胞凋亡保护需要在MIF（100 ng/ml）存在下刺激CD74和CD44（A）COS-7/M6细胞株进行凋亡诱导（AI）24小时，并通过caspase-3活性测量凋亡反应（*p<0.02，Student’s t检验，双尾）。（B） 不同COS-7细胞系细胞溶质组分中p53的Western blotting分析显示，经MIF刺激后，CD74+CD44表达细胞中磷酸化p53（p-p53）含量降低，*p<0.02。（C） MIF诱导凋亡后原代巨噬细胞中Caspase-3活性（*p<0.02，Student’s t检验，双尾）。（D） 在MIF存在和不存在的情况下诱导凋亡后，对小鼠原代巨噬细胞的细胞溶质部分进行Western blotting分析。请注意，小鼠（总）p53抗体检测到一种免疫反应性的p53双抗体，这与之前的观察结果一致（Mitchell等人，2002年）。车道以下的密度值是指磷酸蛋白与总p53蛋白的比值，*p<0.02。（E） 增强激活诱导的CD74-KO和CD44-KO小鼠巨噬细胞凋亡。腹腔注射LPS给野生型、MIF-KO、CD74-KO和CD44-KO小鼠，24小时后从腹腔分泌物中分离出巨噬细胞。图中显示了荧光连接蛋白染色巨噬细胞的典型高倍视野。对照图像显示从盐水处理的小鼠获得的野生型巨噬细胞。定量时，巨噬细胞（5×104每个小鼠的细胞数，n=每个实验组的小鼠数）在多个高倍视野中进行检查，并计数阳性染色细胞（强烈的点状荧光）。野生型、MIF-KO、CD74-KO或CD44-KO的盐水治疗之间未观察到差异（数据未显示）*与盐处理对照组相比，p<0.01（Student’s t检验，双尾）。（F） 寡核苷酸ELISA定量巨噬细胞凋亡。所示值为三口井的平均6 SD，代表了两个实验*与LPS治疗的野生型小鼠相比，p<0.02，**p<0.01与不使用LPS治疗（Student’s t检验，双尾）。误差条表示平均值±SD。
图7
图7
MIF信号转导模型涉及MIF与CD74的结合和CD44辅受体的激活。已经描述了从CD44胞质内结构域通过c-Src通向鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）激活的途径（Bourguignon等人，2001年；Taher等人，1996年）。Ras下游的途径已被描述（Mitchell等人，1999年；Lue等人，2006年），Swant等人（2005年）最近报道了Ras效应器RhoGTPase通过肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和黏着斑激酶（FAK）在诱导持续期MIF-介导的ERK激活中的作用。
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