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.2006年12月；26(24):9220-31.
doi:10.1128/MCB.01453-06。 Epub 2006年10月9日。

内质网应激后激活自噬促进细胞存活

绪方美子 1, Shin-ichiro日野, 齐藤惇, 森川圭介, 近藤信一, 金本宗史, 村上春树, Manabu Taniguchi公司, 伊奇罗·塔尼, 吉贺一弥（Kazuya Yoshinaga）, 佐藤小坂, 詹姆斯·哈马巴克, 富美彦天王星, Kazunori Imaizumi村
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内质网应激后激活自噬促进细胞存活

绪方美子等。 摩尔细胞生物学. 2006年12月.

摘要

真核细胞通过未折叠蛋白反应处理内质网（ER）中未折叠蛋白的积累，包括诱导分子伴侣、翻译衰减和ER相关降解，以防止细胞死亡。在这里，我们发现自噬系统作为一种新的信号通路被激活，以响应内质网应激。用内质网应激源处理SK-N-SH神经母细胞瘤细胞可显著诱导自噬体的形成，这在超微结构水平上可被识别。在内质网应激的细胞中，绿色荧光蛋白（GFP）-LC3标记结构（GFP-LC3“点”）的形成（代表自噬体）被广泛诱导，从LC3-I转化为LC3-II。在IRE1-缺陷细胞或经c-Jun N末端激酶（JNK）抑制剂处理的细胞中，内质网应激诱导的自噬被抑制，表明内质网胁迫后自噬激活需要IRE1-JNK通路。相反，PERK缺陷细胞和ATF6敲除细胞显示，内质网应激后以类似于野生型细胞的方式诱导自噬。自噬障碍使细胞易受内质网应激的影响，这表明自噬在内质网胁迫后的细胞存活中起着重要作用。

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数字

图1。
图1。
内质网应激可激活自噬体的形成。（A） 暴露于2μg/ml Tm、1μM TG或氨基酸剥夺指定时间的SK-N-SH细胞的电子显微镜分析。面板f至i分别是面板b至e的高倍图像。图中显示了典型的自噬体（箭头所示）、自溶体（箭头）和多泡体（用c中的双箭头所示，用g中的插图所示）。比例尺，1μm。（B） 将SK-N-SH细胞暴露于指示刺激2 h后，其自噬体的数量。共制备了30个电子显微镜切片，自噬小体被定义为胞浆中的双膜或多膜结构。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与对照细胞（**，P（P）<0.01）（学生的t吨测试）。（C） 内质网应激后的营养吸收。用2μg/ml Tm或1μM TG处理MEF细胞2 h，然后进行材料和方法中所述的氨基酸摄取分析。结果表示为计数与无Tm或TG时计数的百分比。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。（D） SK-N-SH细胞或ATG5缺乏（ATG5−/−)用内质网应激源处理的MEF（左面板，全视野；右面板，高倍图像）。用GFP-LC3表达载体转染细胞，然后受每个应激源刺激2小时。在暴露于Tm、TG和氨基酸饥饿的细胞中观察到GFP-LC3-标记的点状结构的形成。注意，用10 mM 3-MA和ATG5处理可以抑制GFP-LC3点的形成−/−细胞。（E和F）图D所示SK-N-SH细胞（E）和MEF（F）中GFP-LC3标记的点状区域的量化。总GFP-LC2点状区域与总细胞区域的比率以百分比表示。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与对照细胞（**，P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05）（学生的t吨测试）。WT，野生型。（G） 瞬时转染GFP-LC3表达载体的SK-N-SH细胞的免疫电镜分析。细胞暴露于2μg/ml Tm中6 h。GFP-LC3免疫金颗粒（箭头）存在于自噬体膜上。比例尺，1μm。
图2。
图2。
ER应力对LC3的转化。（A） MEF暴露于各种刺激后内源性LC3的Western blotting。每个应力都会导致LC3-I转换为LC3-II。（B） 蛋白质印迹强度的定量分析。值是每个蛋白质印迹带的任意强度。（C） 在有或无E64d的情况下，暴露于TG后MEF内源性LC3的Western blotting。注意，E64d治疗促进LC3-II的积累。（D） 蛋白质印迹强度的定量分析。
图3。
图3。
IRE1缺陷细胞中的自噬体形成受到抑制。（A） 野生型MEF和IRE1α缺陷MEF中GFP-LC3的自体荧光（左面板，全场；右面板，高倍图像）。在有或无1μM TG的情况下培养细胞2小时。（B和C）量化细胞中GFP-LC3标记的点状区域。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与对照细胞（**，P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05）（学生的t吨测试）。WT，野生型。（D） 量化用IRE1αsiRNA处理的细胞中GFP-LC3标记的点状区域。注意，IRE1βsiRNA处理抑制内质网应激而非氨基酸饥饿诱导的自噬体的形成。右侧面板显示了用IRE1α或对照siRNA（层粘连蛋白A/C）处理的HeLa细胞中的IRE1蛋白水平。在IRE1αsiRNA-处理的细胞中，IRE1β的蛋白质水平降低。
图4。
图4。
IRE1-和PERK缺陷细胞中LC3的处理。（A） 暴露于400 nM TG的MEF中内源性LC3的处理。LC3-I转化为LC3-II不仅在野生型（WT）MEF中检测到，在IRE1αβ中也检测到−/−内质网应激后的MEF。下面的面板显示了用作内部控制的β-肌动蛋白的Western blotting分析。野生型IRE1αβ内源性LC3的（B和D）蛋白质印迹−/−（B） 和PERK−/−（D） 在有或无E64d的情况下暴露于TG后的MEF。（C） 对PERK缺乏细胞中GFP-LC3标记的点状区域进行量化。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与对照细胞（**，P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05（学生的t吨测试）。（E） 每个实验中使用的细胞中GFP-LC3的表达水平。用抗GFP和抗β-肌动蛋白抗体对每个实验的细胞裂解液进行Western blotting分析。
图5：。
图5：。
内质网应激后的自噬被IRE1-JNK途径激活。（A） 全长IRE1α（IRE1 A-full）及其羧基末端缺失突变（IRE1-αΔC）、激酶缺失突变（IR E1αKA）和核糖核酸酶L域缺失突变（R E1αΔRNase）的结构示意图。显示了跨膜（TM）、激酶和核糖核酸酶L结构域的位置。（B） 与每个IRE1α突变体构建物和GFP-LC3的表达载体共转染的IRE1β缺陷MEF中GFP-LC3.的自身荧光。转染后，将细胞暴露于2μg/ml的Tm中2 h。（C）用Tm处理的细胞中GFP-LC3点状区域的定量。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与IRE1α有显著差异−/−单元格（**，P（P）<0.01）（学生t吨测试）。（D） GFP-LC3、IRE1α突变体及其磷酸化形式的表达水平。将GFP-LC3双转染细胞和每个IRE1α构建物的裂解液分别用抗GFP、抗IRE1β和抗磷酸化IRE1γ抗体进行Western blotting。下面的面板显示了每个IRE1突变的磷酸化水平的定量分析，每个蛋白印迹带的强度都是任意的。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与P-full（**，P（P）<0.01）（学生的t吨测试）。（E） JNK抑制剂对内质网应激后自噬体形成的影响。用GFP-LC3表达载体转染野生型MEF，用JNK抑制剂SP600125（SP）（10μM）预处理，然后暴露于氨基酸剥夺（饥饿）和1μM TG 2 h。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。（F） 用TRAF2显性阴性突变（TRAF2 DN）表达载体转染的细胞中GFP-LC3标记的点状区域的定量。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。
图6。
图6。
自噬在抵抗内质网应激诱导的细胞死亡中起着关键作用。（A） 抑制自噬会增加内质网应激的易感性。在有或无3-MA的情况下，用0.5μg/ml Tm或300 nM TG处理SK-N-SH细胞36 h，然后用Hoechst染料染色。注意，用3-MA处理的细胞显示出明显的染色质凝聚和断裂。（B） 图A所示细胞内质网应激诱导细胞死亡的量化。数值为三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与未经3-MA处理的细胞有显著差异（**，P（P）<0.01）（学生的t吨测试）。（C） 将SK-N-SH细胞暴露于2μg/ml的Tm中24小时后，在有或无10 mM 3-MA的情况下，对caspase-3进行Western blotting。内质网应激导致procasase-3裂解。3-MA处理加速其分裂。（D） 内质网应激后ATG5缺陷MEF中细胞死亡的量化。用2μg/ml Tm或1μM TG刺激野生型或ATG5缺乏型MEF达指定时间。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与野生型MEF（**，P（P）<0.01）（学生的t吨测试）。（E） 内质网应激后ATG5缺陷细胞中caspase-3的Western blotting。（F） 用ATG5 siRNA处理的HeLa细胞的细胞死亡测定（左图）。将转染有每个siRNA（最终浓度为10 nM）的细胞在37°C下培养12 h，然后用2μg/ml Tm或50 nM staurosporine（STS）刺激细胞，STS是一种凋亡诱导剂，但不会导致内质网应激，或没有刺激（对照）。注意，ATG5 siRNA通过Tm而不是STS加速细胞死亡。右面板和下面板显示了ATG5 siRNA或控制siRNA（lamin A/C）对HeLa细胞中ATG5 mRNA（右）或蛋白质（低）表达的影响。（G） 用或不用1μM雷帕霉素定量内质网应激后的细胞死亡。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与雷帕霉素处理的细胞（**，P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05）（学生的t吨测试）。
图7。
图7。
内质网应激后JNK激活和自噬体形成。用0.5μg/ml Tm处理细胞1h，然后冲洗培养基并将其更换为新鲜培养基。显示了6小时的LC3点状区域（A）、ER应激后24小时的死细胞数量（B）、磷酸化JNK1的水平（C）和胱天蛋白酶-3的激活（D）。这些值是三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示与对照组（a）和经Tm处理的（B）细胞（**，P（P）<0.01）（学生的t吨测试）。
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