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.2006年12月；26(24):9497-507.
doi:10.1128/MCB.01099-06。 Epub 2006年10月9日。

BRF1蛋白周转和mRNA衰变活性在相同的磷酸化位点受到蛋白激酶B的调节

唐·本杰明 1, 马丁·施密德林, 卢敏, 布里吉特·格罗斯, 克里斯托夫·莫罗尼
附属公司

BRF1蛋白周转和mRNA衰变活性受相同磷酸化位点的蛋白激酶B调节

唐·本杰明等。 分子细胞生物学. 2006年12月.

摘要

BRF1转录后通过将携带ARE的转录物靶向衰变机制来调节mRNA水平。我们之前显示，蛋白激酶B（PKB）磷酸化Ser92处的BRF1，导致与14-3-3结合并损害mRNA衰变活性。在这里，我们确定了Ser203的一个额外调节位点，该位点与Ser92在体内协同作用。体外激酶标记和wortmannin敏感性表明Ser203磷酸化也由PKB完成。两种丝氨酸到丙氨酸的突变将BRF1从PKB调节中解偶联，导致组成mRNA即使在存在稳定信号的情况下也会衰减。BRF1蛋白由于蛋白酶体降解（半衰期<3小时）而不稳定，但在磷酸化后变得稳定，在PKBalpha（-/-）细胞中不太稳定。令人惊讶的是，磷酸化依赖性蛋白的稳定性也由Ser92和Ser203调节，这些位点需要平行磷酸化。只有当两个位点都发生突变时，14-3-3的磷酸化依赖性结合才被废除。细胞室分馏实验支持一种模型，在该模型中，与14-3-3结合可通过重定标来隔离BRF1，并阻止其执行mRNA衰变活动以及蛋白酶体降解，从而保持BRF1蛋白的高水平，这是在稳定信号消散后恢复衰变所需的。

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数字

图1。
图1。
BRF1活性在丝氨酸92和203的体内协同调节。（A） 已知哺乳动物ZFP36/Tis11家族成员BRF1、BRF2、TTP和ZFP36L3的比对揭示了203位的保守丝氨酸（BRF1编号）。除ZFP36L3外，显示了人的序列，这是小鼠特有的。人类和小鼠BRF1蛋白在所示序列上具有完美的同源性。（B） Tet-β-珠蛋白-IL-3 3′UTR报告基因单独转染（1至3道）或与组成性激活的m/pPKB（4至18道）和BRF1wt（7至9道）、BRF1S90A/S92A（BRF1AAS，10至12道）、BREF1S203A（BRF1 SSA，13至15道）或BRF1S90 A/S92A/S203A组合转染（BRF1AA，16至18道。48小时后，通过添加强力霉素（2μg/ml）停止转录。在指定的时间点分离细胞质RNA并进行Northern印迹处理。由于mRNA报告子的起始水平较低，通道1至3和通道16至18的面板暴露时间较长。（C） 显示报告转录信号量化的图表，标准化为来自三个独立实验的肌动蛋白对照。GAPDH的印迹重绘和报告探针对GAPDH衰变的归一化作为独立对照，得出了与肌动蛋白类似的结果（数据未显示）。
图2。
图2。
PKB在丝氨酸203处磷酸化BRF1。（A） 抗磷酸化-Ser203抗体的特性。用BRF1wt（wt）或BRF1S203A突变蛋白（S203A）转染HIRc-B细胞，并用胰岛素刺激30分钟以激活PKB。细胞裂解物与磷酸化和非磷酸化对照肽（pept）一起进行，以查看抗体是否可以从总细胞裂解物中检测到磷酸化Ser203。如有指示，在装载前用λ蛋白磷酸酶（30℃，30 min）处理提取物。磷特异性信号由箭头指示。（B） 含有野生型序列（wt）或S203A突变（S203A）的重组BRF1肽（aa 143至233）与活化激酶PKB、p38、MK2和Erk1以及放射性ATP一起孵育。对样品进行解析，并通过放射自显影术对肽标记进行可视化。（C） PKB磷酸化的条件与B组相同，并滴定增加的肽量。（D和E）以非放射性方式重复上述实验，并用抗磷酸化Ser203抗体对反应产物进行Western印迹。磷酸化信号仅在PKB磷酸化后检测到，在与S203A肽的反应混合物中不存在。
图3。
图3。
BRF1在体内被丝氨酸203磷酸化。（A） 用BRF1wt或BRF1S203A转染HIRc-B细胞，转染后48小时用胰岛素（20μg/ml）或400 nM OA刺激30分钟。如有指示，在刺激前15分钟用WM（200 nM）预处理细胞。用抗磷酸化Ser203 BRF1抗体和抗磷酸化Ser473 PKB检测细胞裂解产物，以显示BRF1 Ser203磷酸化与PKB活性之间的相关性。（B） 用BRF1wt或BRF1S203A转染NIH 3T3细胞，并用400 nM OA刺激30分钟。每个面板左侧显示磷酸化S203特异性信号。
图4。
图4。
BRF1蛋白不稳定。（A） 用嘌呤霉素（Puro；50μg/ml）或50μM环己酰亚胺（CHX）阻断HT1080细胞中的翻译，并在指定时间采集细胞。用抗BRF1抗体检测发现该蛋白迅速衰变。将印迹剥离并针对GAPDH重新处理作为负载对照。slowC细胞（HT1080 BRF1）的裂解液−/−)同时作为BRF1的阴性对照。（B） 用嘌呤霉素阻止翻译，在较早的时间点采集细胞。裂解产物也用λ磷酸酶处理，并与之并行比较。（C） 用嘌呤霉素和蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）处理细胞6小时。在MG132存在下BRF1的稳定性表明其通过蛋白酶体降解。星号表示非特定带。
图5：。
图5：。
磷酸化BRF1是稳定的。（A） 用嘌呤霉素（Puro；50μg/ml）和OA（400 nM）单独或联合处理HT1080细胞6 h，用抗BRF1抗体探测裂解产物。BRF1在OA诱导的细胞中持续存在，即使翻译被阻断，也表明其通过磷酸化而稳定。注意过度磷酸化形式BRF1迁移特征的向上移动。（B）用针对磷酸化-Ser92和磷酸化-Ser 203的磷酸化特异性抗体探测OA诱导细胞（400 nM，3 h）的裂解物，证实HT1080细胞中这些位点被磷酸化。OA治疗后检测到磷酸特异性信号（箭头），对λ磷酸酶（λPPase）敏感。（C） 用抗BRF1抗体检测B组裂解液。OA处理后BRF1各带向上移动，经λ磷酸酶去磷酸化后恢复为单个高迁移率带。（D） 一系列BRF1磷酸化缺失突变体在慢C细胞中稳定表达。如A组所述，对BRF1进行翻译阻滞和OA诱导的磷酸化。尽管OA诱导过度磷酸化，BRF1AAA蛋白的组成不稳定性表明这些位点对磷酸化依赖性稳定至关重要。与内源性蛋白不同，由于存在His和Xpress标记，转染BRF1在OA治疗后的迁移率略高于非特异性带（与面板A相比）。星号表示非特定带。
图6。
图6。
PKB活性影响BRF1水平。（A） 将Myc-tagged BRF1wt或S90/92/203A突变体（BRF1AAA）转染到PKBα+/+和PKBα−/−MEF公司。在指定的时间段内，通过添加嘌呤霉素（puro；50μg/ml）停止翻译，并通过针对myc标签和GAPDH（负载控制）的Western blotting测定蛋白质水平。对于BRF1wt转染的细胞，显示了两种不同的Western blot暴露。（B） 在翻译停止（嘌呤霉素）或添加蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）后，测定MEF细胞中内源性BRF1的水平。
图7。
图7。
从对照和OA诱导的HT1080细胞中的主要亚细胞隔室中分离蛋白质。用10进行分馏6细胞，每个组分负载10μg蛋白质。用各自的抗体确定BRF1和14-3-3的定位。对该印迹和相同提取物对已知标记蛋白组蛋白H1（核）、微管蛋白（细胞骨架）和GAPDH（细胞溶质/膜）进行的平行印迹的重配证实了分馏的完整性。星号表示非特异性带。
图8。
图8。
BRF1-14-3-3配合物的共沉淀。（A） 将未经PKBα修饰或体外磷酸化的重组His-BRF1（40 ng）添加到40μg慢C细胞S100提取物中。与镍珠结合并洗涤后，在SDS-PAGE上运行洗脱部分，并针对14-3-3和BRF1进行探测（作为沉淀控制）。（B） 利用ARE RNA探针进行体外RNA衰变试验，测试各种重组BRF1蛋白的生物活性（39）。所有蛋白质都能促进探针的快速衰变，表明其具有适当的构象和活性。
图9：。
图9：。
BRF1活性和蛋白质稳定性的协调调节模型。在默认状态下，BRF1在Ser92和Ser203处未磷酸化，并积极促进ARE mRNA的衰变，同时由于蛋白酶体降解而快速转换。一个特定的mRNA-稳定信号导致PKB活化，从而使这些位点磷酸化。这会触发磷酸化依赖性BRF1与14-3-3的结合和复合体的移位，而复合体现在无法促进mRNA的衰变，也无法以蛋白酶体为靶点进行降解。一个悬而未决的问题是BRF1上是否存在进一步的磷酸调节位点，它富含丝氨酸/苏氨酸，也可能通过14-3-3-依赖性机制调节其活性。
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