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.2007年3月；14(3):453-61.
doi:10.1038/sj.cdd.4402043。 Epub 2006年9月29日。

死亡受体结扎触发高尔基体和线粒体之间的膜混乱

S乌瓦斯蒂 1, P马塔雷斯, R帕登, R Khosravi-Far公司, M Sorice女士, 蒂纳里, W马洛尼, M Degli Esposti先生
附属公司

死亡受体结扎触发高尔基体和线粒体之间的膜混乱

S乌瓦斯蒂等。 细胞死亡差异. 2007年3月.

摘要

亚细胞器如线粒体、内质网和高尔基复合体参与细胞死亡程序的进展。我们在此报告，在II型细胞中连接Fas（CD95/Apo1）后不久，高尔基复合体的元素与线粒体混合。这种混合遵循分泌膜的离心扩散，反映了膜交通的全球变化。顶端caspase的激活有助于促进分泌细胞器的扩散，因为caspase抑制可阻止高尔基体相关内膜的向外运动并减少其与线粒体的混合。caspase抑制剂还可阻止FasL诱导的细胞内蛋白酶从溶酶体小室分泌，概述了通过心尖半胱天冬酶传递死亡受体信号的一个新方面。因此，我们的研究揭示了Fas配体介导的凋亡通过顶端半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶调节的膜交通的整体改变，诱导线粒体和分泌细胞器的混乱。

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数字

图1
图1
FasL处理后高尔基体和线粒体膜的混乱。(一)采用CaspGLOW荧光素活性半胱氨酸蛋白酶染色法，通过流式细胞术测定CEM细胞中caspase-8的活性（见材料和方法）。该测定利用与FITC结合的特异性胱天蛋白酶抑制剂IETD-FMK来标记完整细胞内的活性胱天蛋白酶8。每个面板中的数字是指显示归因于活性胱天蛋白酶-8的增强荧光的细胞的百分比。通过双参数分析，在FasL治疗的1小时内，细胞凋亡的基础水平（<2%的细胞）没有显著增加。(b条)未经处理或经FasL处理的CEM细胞的三色免疫荧光图像（1小时，如一)采用IVM技术采集，即使用CCD摄像机和一个×100物镜进行拍摄，然后使用图像分析软件（OPTILAB，Graftek，法国）进行背景处理。细胞核用Hoechst染料染色，高尔基染色用抗GM130单克隆抗体（红色）染色，并结合线粒体染色（MTR-Green，MTR）。注意黄色染色，表明高尔基体/线粒体重叠，以及处理细胞中线粒体的部分极化（第二排）。(c（c）)同一处理细胞的TEM分析(b条)显示FasL促进的水泡事件。请注意高尔基体柄与线粒体之间的紧密接触（左图），囊泡向线粒体方向出芽（中图），小囊泡与线粒体合并（右图）。插图：中间面板中装箱区域的高倍放大（×40 000）
图2
图2
FasL处理后高尔基体膜与线粒体部分重叠。(一)Jurkat细胞分别用FasL处理30分钟（i）和60分钟（ii），并在等渗分离后用不同的膜标记物进行标记（cf.15）。随后用印度墨水进行全局蛋白质染色，得到相同的负载量（ii中的底部面板，右侧）。(b条)通过使用最先进的Deltavision RT系统与带有×100物镜的自动奥林巴斯IX71显微镜耦合，获得了经过10次反褶积循环（软件Rx.3.4.3，Applied Precision）后获得的33个0.2 nm z截面的投影图像。细胞首先用50 nM MTR红染色，然后进行ERGIC53免疫染色。注意，未经处理的细胞中这种染色聚集，反映了高尔基体近端周围ERGIC元件的主要联系。(c（c）)用Deltavision RT采集FasL处理1 h前后Jurkat细胞的荧光反褶积图像，如(b条). 首先用50 nM MTR对线粒体进行染色，然后用单克隆抗GM130（BD Pharmingen）进行免疫标记。通过15个反褶积循环获得33个0.2 nm z截面的投影图像，然后使用Deltavision RT软件（阈值设置为50 dpi–右侧面板）进行计算机辅助分色以实现证据共同定位。底部的插入物是分散高尔基体染色合并图像中方框区域的放大倍数
图3
图3
FasL诱导内膜的整体运动。(一)在ERGIC53免疫标记后，使用Alexa Fluor488-HPA（绿色）进行双重高尔基染色，与图2b中的图像不同，使用红色荧光二级抗体证明。用60倍物镜采集31个z断面的投影图像，并用Deltavision RT软件进行10个周期的去卷积。HPA染色是在没有凝集素预吸收的情况下进行的，以清晰地定义细胞轮廓。注意这种表面染色在FasL处理的细胞中的扩散。(b条)德克萨斯州红结合HPA（HPA外部，20μg/ml）与FasL（0.5μg/ml）转移到活细胞中，并在37°C的RB中孵育40分钟。清洗后，将细胞固定、渗透，然后用GM130（左）和ERGIC53（仅右合并图像）进行免疫染色，如图2c所示。获得了34个z截面的投影图像，如下所示(一). (c（c）)Jurkat细胞首先加载50 nM MTR（参见图2），然后离心并连接到盖玻片上，用未标记的HPA（52μg/ml），渗透，然后用2μg/ml Alexa Fluor488-HPA（绿色）显示细胞内膜，优先于表面染色（与一). 获得了56个z截面的投影图像，如下所示(一). (d日)用从处理过的小鼠肝脏分离的线粒体定量测量HPA与膜的结合体外在与淋巴瘤细胞诱导细胞死亡相同的条件下使用FasL（参考38）。得克萨斯州红色共轭HPA（50μg/ml）与40μg/ml线粒体蛋白和8μg/ml高尔基蛋白（黑色直方图，从大鼠肝脏中纯化的高尔基是曼彻斯特大学M Lowe博士赠送的礼物）在37°C的分析缓冲液中放置30分钟。然后通过离心分离和清洗膜，在分析缓冲液中重新悬浮，并转移到四个孔中，以便在平板读取器中进行荧光测量（544 nm激发，590 nm发射）
图4
图4
膜交通的改变和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制的作用。(一)移动膜元件的双重染色是通过用Texas-red-conjugated HPA（外部，20μg/ml）同时作用于FasL（0.5μg/ml），如图3b所示。相同细胞的等分样品与50个μ添加FasL之前的M z-VAD。固定后，用未标记的HPA（52μg/ml），渗透，然后用Alexa Fluor 488-HPA染色（静态HPA，2μg/ml，持续5分钟）。洗涤和安装后，使用Deltavision RT去卷积显微镜获得图像，如图3c所示（从40到60个z切片）。(b条)在与中相同的实验中，在稍后的时间点获得合并的图像(一)并由34个z截面的去卷积投影导出。(c）FasL缺失和存在时Jurkat细胞HPA摄取和染色的时间进程（如一). 细胞在37°C下在含有10μg/ml德克萨斯红结合HPA；在指定的时间，细胞在冷态下离心，并在不含HPA的相同缓冲液中重新悬浮。计数后，将每个样品的40000个细胞装入四个孔中，并在平板读取器中测量残留荧光，如图3d所示。双HPA染色的代表性图像，如(一)插入指定的培养时间。注意1小时内HPA摄取量的瞬时增加
图5
图5
半胱氨酸天冬氨酸酶调节线粒体和其他细胞器的亚细胞变化。(一)如图2c所示，在FasL处理40分钟后，以及在预培养50分钟后，进行GM130的单一染色μM z-VAD，但使用红色荧光二级抗体，如图1b所示。如图3b所示，获得了35个z截面的投影图像。(b条)FasL处理1小时后，以及与50μM z-VAD持续30分钟。底部面板显示线粒体外膜标记蛋白的重嵌。(c（c）)在无FasL和有FasL的情况下，用FasL（1 h）处理的细胞的三色免疫荧光图像μM IETD-CHO公司。IVM数据如图1b所示
图6
图6
在Fas信号传导期间，半胱天冬酶加速溶酶体标记物的分泌。(一)Jurkat细胞在37°C的含10μg/ml BODIPY TR结合酪蛋白，一种蛋白酶的荧光底物（EnzChek®31），然后在全生长培养基中清洗和追逐1小时。在RB中重新悬浮后，在没有z-VAD的情况下（培养20分钟），细胞未经处理或用FasL处理1小时，如图5b的实验所示。固定后，用2μg/ml Alexa Fluor488-HPA（绿色）评估表面变化。在未经处理的细胞中，EnzChek染色了一系列外围和皮层颗粒（通常每个细胞6-8个），这些颗粒在追逐数小时后保持相对稳定，并与分泌溶酶体相对应（底部面板显示追逐后立即出现的对照细胞的代表性图像）。Fas活化强烈减少了这些颗粒的数量，而z-VAD抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶则恢复了它们的正常频率和分布。如图3c所示，从54个z截面获得了去卷积图像。(b条)用蛋白酶的荧光底物对Jurkat细胞进行双重标记。使用EzCheck进行染色，如(一)但同时摄入10μM罗丹明110-FR-双酰胺，组织蛋白酶L的一种荧光底物。该底物产生绿色荧光，限制在几个小液泡中，其中一些与EnzChek标记的液泡共存。FasL处理1小时后，细胞内外（左侧面板）均出现扩散的绿色荧光，部分原因是溶酶体室释放组织蛋白酶。然而，z-VAD预处理大大减少了绿色荧光的扩散，同时增加了其在与分泌溶酶体重叠的液泡中的局灶浓度（右图）。合并的图像是未去卷积的52个z截面的投影，以更好地显示绿色荧光的扩散模式。(c（c）)用EnzChek培养细胞，然后像在(一,b条); 清洗后，它们以2×10的速度重新悬浮6/在加入FasL后，在24°C的荧光计中连续监测RB中的ml和细胞内EnzChek的荧光（箭头所示）。1小时后，离心相同的细胞，并用新鲜的EnzCheck（20μg/ml）以测量释放的蛋白酶的活性（同样在24°C下）。与对照细胞（未显示）或z-VAD-处理细胞（中间迹线）相比，Fas处理细胞的上清液显示出蛋白酶活性的强烈增加。底部的虚线表示仅包含EnzChek的空白。(d日)在无z-VAD和有z-VAD的情况下，用FasL处理细胞45分钟，测定细胞上清液中组织蛋白酶L的活性(b条)（参见图4）使用1μM罗丹明110-FR-双酰胺，37°C，pH 6.0。平均费率(n个=3）使用平板读取器测量，如图4c所示。右边的直方图显示，在5μ组织蛋白酶通用抑制剂M E-64
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