跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并且被安全地传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2006年11月；26（22）：8623-38。
doi:10.1128/MCB.00487-06。 Epub 2006年9月5日。

KAP1共表达子的功能是协调KRAB锌指蛋白介导的转录抑制所需异染色质的从头HP1标定微环境的组装

Smitha P Sripathy公司 1, 杰西卡·史蒂文斯, 大卫·C·舒尔茨
附属公司

KAP1共表达子的功能是协调KRAB锌指蛋白介导的转录抑制所需异染色质的从头HP1标定微环境的组装

Smitha P Sripathy公司等。 分子细胞生物学. 2006年11月.

摘要

KAP1/TIF1beta被认为是转录抑制因子KRAB锌指蛋白（KRAB-zfp）超家族的通用共抑制蛋白。为了表征KAP1和KAP1相互作用蛋白在转录抑制中的作用，我们研究了激素反应性KRAB和KAP1-阻遏蛋白对稳定整合报告基因的调控。在这里，我们证明了小干扰RNA（siRNA）对内源性KAP1水平的消耗显著抑制了KRAB介导的染色质模板的转录抑制。同样，siRNA降低HP1alpha/beta/gamma和SETDB1的细胞水平可以减弱KRAB-KAP1的阻遏作用。我们还发现，KAP1与DNA的直接连接足以抑制整合转基因的转录。这种活性完全依赖于KAP1与HP1的相互作用，以及KAP1的完整PHD指和溴结构域，这表明这些结构域在转录共表达中协同作用。野生型KAP1抑制状态的实现涉及RNA聚合酶II招募减少，组蛋白H3 K9乙酰化和H3K4甲基化水平降低，组蛋白占有率增加，三甲基组蛋白H3K9、H3K36和组蛋白H4K20富集，以及转基因近端调控序列中HP1沉积。含有HP1结合域突变的KAP1蛋白未能诱导与转基因DNA序列相关的组蛋白修饰发生任何变化，这意味着HP1定向的核区隔化是KRAB/KAP1阻遏复合体转录抑制所必需的。这些数据的结合表明，KAP1的功能是协调动态调节组蛋白修饰和HP1沉积变化的活动，以建立异染色质的从头开始微环境，这是KRAB-zfps抑制基因转录所必需的。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
KRAB介导的抑制需要KAP1。（A） 使用识别KAP1 N末端（抗RBCC）或C末端（抗PHD/溴）的抗体，对两个独立稳定的敲除细胞系中内源性KAP1表达进行Western blot分析。检测Rbap48（p48）作为负荷控制。（B） 5XGAL4-TK-核糖核酸酶报告子和GAL-KRAB阻遏蛋白的示意图。（C） 用p5XGAL4-TK-核糖核酸酶报告子和表达GAL4-KRAB阻遏蛋白的指定数量的质粒瞬时转染稳定的KAP1敲除细胞（cl4和cl10）。转染48小时后测量荧光素酶活性，并对转染效率进行标准化。压制(n个-fold）表示在没有任何效应质粒的情况下，标准化荧光素酶活性与在存在指示数量的GAL4-KRAB质粒转染的情况下测得的活性的比率。这些数据表示两个独立实验的平均值，共做了三次。误差条表示平均值的标准偏差。
图2。
图2。
KAP1的共抑制剂活性取决于它与HP1、功能性PHD指和溴代多巴胺的相互作用。（A） KAP1的结构域和合成引入突变的位置示意图。（B） 用p5XGAL4-TK-luciferase报告子、100 ng pM1-KRAB和表达FLAG-tagged KAP1（野生型[WT]、RV487、488EE、W664A和F761A）的质粒瞬时转染稳定的KAP1敲除细胞。转染48小时后测量荧光素酶活性，并对转染效率进行标准化。按图1所示计算抑制。数据代表两个独立的实验，一式三份。误差条表示平均值的标准偏差。明显没有误差条表示标准偏差太小，无法进行物理说明。（C） 转染HEK293细胞的Western blot分析，确认FLAG-KAP1蛋白的稳定外源表达（使用抗FLAG和抗RBCC抗体）。β-肌动蛋白代表一种负荷控制。
图3。
图3。
激素调节报告基因转基因细胞系的建立。（A） 生成具有稳定整合的5XGAL4-TK-核糖核酸酶报告子和激素反应阻遏蛋白组成表达的细胞系的策略。（B） 异源激素反应阻遏蛋白示意图。KAP1的KRAB结构域（Kox1氨基酸1至90）或氨基酸293至835（野生型、RV487、488EE、W664A、L720A和F761A）在框架中融合到ERHBD-GAL4 DNA结合域融合的C末端。
图4。
图4。
ERHBD-GAL4-KRAB对染色质模板的激素依赖性抑制需要KAP1。（A，上面板）ERHBD-GAL4-KRAB对激素依赖性阻遏的动力学。细胞在含有0.1%乙醇或500 nM 4-OHT的培养基中培养指定时间。压制(n个-fold）是指在没有激素的情况下，标准化荧光素酶活性与有激素的情况下标化荧光素酶活性的比值。数据表示三次独立实验的平均值，误差条表示平均值的标准偏差。（下图）使用针对GAL4-DNA结合结构域的抗体检测所示细胞克隆中ERHBD-GAL4-KRAB（箭头）的表达。检测Rbap48（p48）作为负荷控制。（B） 实验方案概述。12.10Kr细胞接受两轮转染100 nM的独立dsRNA寡核苷酸，目的是在用0.1%乙醇或500 nM 4-OHT处理48 h之前降低KAP1的表达。（C）对第6天从转染细胞中制备的具有指示siRNA的全细胞提取物进行Western blot分析。（D）靶向KAP1 mRNA不同区域的独立siRNA分子短暂耗尽KAP1，导致激素依赖性KRAB介导的抑制减弱。按面板A所述计算抑制。数据代表两个独立实验，一式三份。误差条表示平均值的标准偏差。UT，未转染。
图5：。
图5：。
ERHBD-GAL4-KAP1对染色质模板的激素依赖性抑制。（A） ERHBD-GAL4-KAP1在所示细胞克隆中对激素依赖性转录抑制的动力学。细胞在含有0.1%乙醇或500 nM 4-OHT的培养基中培养指定时间。按照图4A所述计算抑制。数据表示一式三份的两个独立实验的平均值，误差条表示平均值的标准偏差。（B） 使用针对GAL4 DNA结合域的抗体检测所示细胞克隆中ERHBD-GAL4-KAP1的表达（箭头）。β-肌动蛋白表达作为负荷对照。（C） 表达ERHBD-GAL4-KAP1蛋白（野生型[WT]、RV487、488EE、W664A、L720A和F761A）的稳定细胞系的Western blot分析。底部的数字表示每个ERHBD-GAL4-KAP1蛋白的表达水平（任意单位），归一化为β-actin表达。（D） 所示细胞系在含有0.1%乙醇或500 nM 4-OHT的培养基中培养96小时。按照图4的图例所述计算抑制。数据表示三次独立实验的平均值，误差条表示平均值的标准偏差。
图6。
图6。
ERHBD-GAL4-KAP1抑制的荧光素酶转基因的染色质免疫沉淀分析。（A） 5XGAL4-TK-核糖核酸酶转基因示意图。粗体线表示从免疫沉淀中回收的DNA中PCR扩增的转基因的四个区域。（B） 在含有0.1%乙醇或500 nM 4-OHT的培养基中生长96 h的12.32KA细胞的甲醛交联染色质用针对所示抗原的抗体进行免疫沉淀。在指定的位点对免疫沉淀DNA进行PCR扩增，以检测低磷酸化RNA聚合酶II募集、组蛋白H3占位、组蛋白修饰（左侧）中的激素依赖性变化以及HP1和SETDB1占位的变化（右侧）。输入的DNA分别占免疫沉淀DNA总量的0.25%、0.125和0.0625%。
图7。
图7。
用4-OHT治疗后，KAP1-HP1相互作用的破坏未能诱导RNA聚合酶II募集、组蛋白占据和组蛋白修饰（A）或HP1/SETDB1募集到荧光素酶报告子（B）启动子序列中的激素依赖性变化。在含有0.1%乙醇或500 nM 4-OHT的培养基中生长96 h的12.11M2细胞的甲醛交联染色质用针对所示抗原的抗体进行免疫沉淀。PCR扩增免疫沉淀中恢复的启动子和3′荧光素酶编码序列。输入的DNA占免疫沉淀DNA总量的0.25、0.125和0.0625%。
图8。
图8。
染色质模板的激素依赖性KRAB阻遏需要KAP1、HP1和SETDB1。12.10Kr细胞接受两轮dsRNA寡核苷酸转染，以暂时降低所示蛋白质的水平，如图4B的图例所示。为了三重敲除HP1α、-β和-γ，用50 nM siRNA转染细胞到每个靶点。（A） 对第6天制备的细胞全细胞提取物进行Western blot分析，该细胞转染了指示的siRNA.UT，未转染。（B） 短暂耗尽KAP1、HP1和SETDB1可减弱染色质模板的激素依赖性KRAB阻遏。这些数据表示两个独立实验的平均值，共做了三次。误差条表示平均值的标准偏差。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. Abrink，M.、J.A.Ortiz、C.Mark、C.Sanchez、C.Looman、L.Hellman、P.Chambon和R.Losson。不同Kruppel-associated盒结构域和转录中介因子1β之间的保守相互作用。程序。国家。阿卡德。科学。美国98:1422-1426。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Agata，Y.、E.Matsuda和A.Shimizu。1999年。两种新的Kruppel相关的含盒锌指蛋白KRAZ1和KRAZ2通过与辅升压因子KAP-1（TIF1β/KRIP-1）的功能相互作用抑制转录。生物学杂志。化学。274:16412-16422.-公共医学
    1. Ayyanathan，K.、W.J.Fredericks、C.Berking、M.Herlyn、C.Balakrishnan、E.Gunther和F.J.Rauscher III。2000年。靶向PAX3-FKHR癌基因的可诱导转录阻遏物导致体内激素依赖性肿瘤消退。癌症研究60:5803-5814。-公共医学
    1. Ayyanathan，K.、M.S.Lechner、P.Bell、G.G.Maul、D.C.Schultz、Y.Yamada、K.Tanaka、K.Torigoe和F.J.Rauscher III，2003年。HP1对常染色体基因的调节性补充诱导有丝分裂遗传的表观遗传基因沉默：基因多样性的哺乳动物细胞培养模型。基因发展17:1855-1869。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Beckstead，R.、J.A.Ortiz、C.Sanchez、S.N.Prokopenko、P.Chambon、R.Losson和H.J.Bellen。Bonus是TIF1蛋白的果蝇同源物，与核受体相互作用，可以抑制βFTZ-F1依赖性转录。分子细胞7:753-765。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语

物质