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.2006年8月2日；26(31):8057-68.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2261-06.2006。

轴突营养不良和变性中自噬的诱导

王庆军 1, 丁耀美, D斯塔夫·科茨, Noboru水岛, Ileana M Cristea先生, 迈克尔·普劳特, 布莱恩·查特, 云忠, 纳撒尼尔·海因茨, 岳振宇
附属公司

轴突营养不良和变性中自噬的诱导

王庆军等。 神经科学. .

勘误表in

  • 神经科学杂志。2006年8月15日；26（33）：1 p先于8409。Kohtz，Stave[更正为Kohtz、D Stave]

摘要

自噬是细胞质内容物大量降解的一种高度调节的细胞机制。它与神经疾病相关的各种生理和病理条件有关。然而，神经元自噬的调节及其在神经元和轴突病理学中的作用尚不清楚。利用产生绿色荧光蛋白标记自噬标记物微管相关蛋白轻链3（GFP-LC3）的转基因小鼠，我们为诱导Lurcher小鼠轴突营养不良和Purkinje细胞变性的自噬提供了分子证据，这是一种兴奋毒性神经变性模型。我们表明，Lurcher突变的兴奋毒性损伤触发Purkinje细胞的早期反应，涉及GFP-LC3标记的自噬体在轴突营养不良性肿胀中的积聚（CNS轴突病变的标志）。在大脑中，LC3与微管相关蛋白1B（MAP1B）具有高亲和力。我们发现MAP1B与细胞溶质形式（LC3I）和脂质形式（LC32I）的LC3结合。此外，在细胞培养中，MAP1B的过度表达导致LC3II水平降低，GFP-LC3标记的自噬体数量减少；磷酸化的MAP1B与GFP-LC3标记的自噬体相关。此外，在大脑中，磷酸化MAP1B在退化Purkinje细胞的轴索营养不良肿胀中积聚，并以增加的水平与LC3结合。因此，在正常和致病条件下，MAP1B-LC3相互作用可能参与神经元尤其是轴突中LC3相关自噬体的调节。我们认为自噬的诱导是轴突营养不良的早期应激反应，可能参与轴突结构的重塑。

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数字

图1。
图1。
GFP–LC3的DCN中Purkinje细胞肿胀轴突中GFP–LC 3的积累/卢彻老鼠。A类，典型的共焦图像显示GFP–LC3在GFP–LC 3的DCN（封闭区域）中重新分布到绿色病灶/卢彻老鼠(A2类,A4（A4）). 以GFP–LC3转基因小鼠为对照(A1类,A3号). 单克隆抗NeuN抗体（1:200）免疫染色显示为红色。比例尺：A1类,A2类，100微米；A3号,A4（A4），20微米。BGFP–LC3的DCN中GFP–LC 3绿色荧光与单克隆抗钙结合蛋白抗体（1:1000）的红色免疫荧光染色重叠/卢彻老鼠。比例尺，20μm。CGFP–LC3的DCN中肿胀的Purkinje细胞轴突中GFP–LC 3（绿色）和磷酸化的Tau（红色；用单克隆抗磷酸化Tau抗体AT-8染色，1:250）/卢彻老鼠。比例尺，20μm。在两者中B和C，星号代表小脑核。
图2。
图2。
GFP–LC3中退化Purkinje细胞轴突营养不良肿胀中自噬的诱导/鲁彻老鼠。A类典型的共焦图像显示退化Purkinje细胞（P12）轴突营养不良肿胀内的GFP–LC3点。比例尺，5μm。B，典型的电子显微镜图像显示退化Purkinje细胞（P10）的轴突营养不良肿胀。许多自噬体（箭头）、自溶体（箭头）和萎缩的线粒体（三角形）在轴突营养不良肿胀中积累。此外，位于轴突营养不良性肿胀上的两个突触被标记为红色星号。比例尺，1μm。插图显示了野生型小鼠DCN的代表性图像。两个轴突被标记为：1，有髓；2，轴突末端有两个突触（红色星号）。比例尺，0.15μm。请注意，控制轴突的大小明显小于轴突营养不良肿胀的大小。C轴索营养不良性肿胀的典型免疫电镜图像(C1类)退化的浦肯野细胞（P10）和四个自噬体/自溶体的放大图像(C2–C5)从18幅免疫电镜图像中筛选出的金颗粒显示，包被多克隆抗GFP抗体（1:5000）的金颗粒主要与自噬体有关。比例尺：C1类，1μm；C2–C5，0.2微米。D类，培养的小脑切片中退化的浦肯野细胞轴突营养不良肿胀的GFP–LC3荧光（绿色）和LysoTracker染色（红色）的实时成像显示GFP–LC3和LysoTracker的部分共定位（底行）。野生型控制（顶行）显示GFP–LC3水平较低，没有LysoTracker标记。未观察到GFP–LC3点。比例尺，5μm。
图3。
图3。
GFP–LC3标记的轴突营养不良性肿胀的形成作为退化Purkinje细胞的早期反应卢彻老鼠。A类，典型的共焦图像显示GFP–LC3标记的轴突营养不良性肿胀在小脑白质轴突束（顶行）和GFP–LC 3退化Purkinje细胞的DCN（底行）中的发展/卢彻不同出生日龄的小鼠。比例尺，20μm。B，中图像的量化A类显示GFP–LC3退化Purkinje细胞的DCN中轴突营养不良性肿胀的密度/卢彻小鼠（正常化为P14）在P10和P14之间处于峰值水平。P7、P10、P14、P18和P28年龄段用于量化的图像数量分别为13、14、16、7和5。错误栏指示SE。
图4。
图4。
在表达GFP–LC3的转基因小鼠脑中鉴定MAP1B作为主要LC3结合蛋白。A类考马斯蓝染色SDS-PAGE显示了通过免疫亲和纯化从野生型（WT）或GFP–LC3转基因（TG）小鼠脑提取物（P30）中分离的蛋白质，并通过质谱分析进行了鉴定。即使在非常严格的洗涤条件下，分离物中也存在MAP1B。从泳道1到6，洗涤严格性增加如下：泳道1和2，200m米氯化钠和0.15%吐温20；车道3和4，200 m米NaCl和0.15%Triton X-100；车道5和6，400 m米氯化钠和0.3%Triton X-100。第7巷，使用GFP–LC3转基因小鼠（P10）在低洗涤强度（120 m）下对全脑进行大规模纯化米氯化钠和0.1%Triton X-100）。有关免疫亲和纯化和质谱分析的详细信息，请参见方法和材料以及补充图3（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料).B使用转染MAP1B–myc（3、4道）或对照FLAG–GluRδ2（1、2道）质粒的HEK 293T细胞进行的免疫共沉淀（CoIP）实验显示MAP1B-myc与LC3I和LC3II都有特定的相互作用。此外，MAP1B过度表达降低LC3II水平。转染细胞要么饥饿（2、4道），要么在正常培养基条件下培养（1、3道）。使用抗myc抗体进行免疫沉淀。在联合免疫沉淀前（INPUT，1-4通道）和后（αmyc-Co-IP，5-8通道），使用抗LC3抗体通过Western blot检测内源性LC3I和LC3II。控制质粒显示在通道1、2、5和6中；MAP1B–myc质粒显示在通道3、4、7和8中。
图5。
图5。
MAP1B–myc的过度表达降低了GFP–LC3点的数量，但对整体自噬活性影响不大。A类转染GFP–LC3的MEF细胞的典型共焦图像仅显示弥漫性细胞溶质和核GFP–LC 3定位以及细胞溶质GFP–L C3点。比例尺，10μm。B，共转染GFP–LC3和MAP1B–myc的MEF细胞的典型共焦图像显示GFP–LC 3（绿色）和MAP1B-myc（红色）的弥漫性细胞溶质共定位（顶行）。与GFP–LC3和LacZ–myc共同转染的对照细胞显示出广泛的核GFP–LC 3定位和细胞溶质GFP–LCD 3点（底行）。细胞固定并用抗myc抗体染色（小鼠，1:1000）。比例尺，10μm。C与转染LacZ–myc的细胞相比，使用GFP–LC3 puncta对MEF细胞分数进行量化显示，使用MAP1B–myc时，使用GFP-LC3 putta的细胞数量大大减少（～20%）。D类MEF细胞中每细胞GFP–LC3点平均数量的量化显示，与转染LacZ–myc（>10）的细胞相比，MAP1B–myc存在时每细胞GFP-LC3点的平均数量（<5）大大减少。对于两者C和D类，转染MEF细胞在200 n时用雷帕霉素（Rap）处理米如图所示，在某些情况下持续18小时。共有83、73、183和218个细胞分别用于转染GFP–LC3和LacZ–myc的细胞（未经雷帕霉素处理）和转染GFP-LC3和MAP1B–myc但未经雷巴霉素处理的细胞。低或高LacZ–myc或MAP1B–myc表达水平的细胞分别进行量化，详见材料和方法。只有在低MAP1B–myc表达水平下，雷帕霉素才能显著增加每个细胞GFP–LC3点的平均数量，而雷帕霉素的自噬激活不受LacZ–myc的表达水平影响。具有统计显著性的比较(对<0.05）标记为*，无显著比较(对≥0.05）标记为**。E类，MAP1B的过度表达并没有导致S6核糖体蛋白磷酸化的废除（自噬诱导试验）或p62/SQSTM1的积累（自吞噬降解抑制试验）。用MAP1B–myc（2、4、6道）或对照质粒FLAG–GluRδ2（1、3、5道）转染HEK 293T细胞48 h。细胞在正常条件下培养（1、2道）或用巴非霉素A1处理（200 n）米; 使用MAP1B、磷酸-S6、总S6、p62/SQSTM1或LC3抗体制备细胞裂解液用于免疫印迹分析。每条通道都装载了40μg蛋白质。
图6。
图6。
内源性磷酸化MAP1B与GFP–LC3标记的自噬体在野生型MEF细胞中共定位，并且在自噬受损时不会积累。A类，与p62/SQSTM1和LC3II相比，在巴非霉素A1（100 n米; Baf，车道2）或雷帕霉素（200 n米; 与未经处理的细胞（Ctl，通道1）相比，野生型MEF细胞中的Rap（通道3）持续18小时。将含有约40μg蛋白质的细胞提取物加载到每条通道上，用MAP1B、MAP1B-P、p62/SQSTM1和LC3进行免疫印迹分析。B，内源性MAP1B（-P）水平在附件7+/−（车道1）和附件7−/−（通道2）MEF细胞与p62/SQSTM1和LC3II细胞相似，通过免疫印迹分析检测。肌动蛋白被用作负荷控制。CWestern blot分析MEF细胞内内源性MAP1B或MAP1B-P，未转染（1、3道）或转染GFP–LC3质粒（2、4道）。免疫印迹显示野生型MEF细胞（1区）中内源性MAP1B或MAP1B-P水平较低但可检测到。MAP1B-P与GFP–LC3结合，如使用抗GFP抗体进行免疫沉淀所示，然后检测MAP1B-P（第4条车道）。CoIP，免疫共沉淀。D类，转染GFP–LC3并用抗MAP1B抗体PP172免疫染色的野生型MEF细胞的典型共焦图像显示GFP–LC 3和内源性MAP1B-P的共定位。比例尺，20μm。
图7。
图7。
GFP–LC3轴突营养不良性肿胀中与GFP–LC3结合的MAP1B-P数量增加/卢彻浦肯野细胞。A类，GFP–LC3小脑切片的典型共焦图像/卢彻用抗MAP1B-P抗体（PP172）免疫染色的小鼠（P10）在退化Purkinje细胞的轴索营养不良肿胀中显示GFP–LC3（绿色）和MAP1B-P（红色）的部分共定位。比例尺，20μm。B、野生型（WT）、GFP–LC3转基因（TG）和GFP–LC 3小脑组织提取物（INPUT）的Western blot分析/卢彻小鼠（TG+LC）及其抗GFP免疫沉淀剂（αGFP-CoIP）显示，GFP-LC3中MAP1B-P与GFP–LC3的结合增加，但MAP1B与GFP-LC3的连接没有增加/卢彻小脑与GFP–LC3转基因小脑的比较。阴性对照显示抗GFP免疫沉淀中缺乏内源性LC3、beclin 1或calbindin。
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