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2005年4月;1(1):23-36.
doi:10.4161/auto.1.1.1495。 Epub 2005年4月21日。

在活细胞中观察到的自噬动力学:从自噬体的形成到与内/溶酶体的融合

附属机构

在活细胞中观察到的自噬动力学:从自噬体的形成到与内/溶酶体的融合

爱德华·T·W·班普顿等。 自噬 2005年4月

摘要

自噬与一系列疾病有关,因此引起了人们的极大兴趣。然而,由于缺乏合适的标记物,实时成像自噬受到了阻碍。我们比较了广泛用作自噬体标记物的单丹酰尸胺和Atg8同源物LC3在荧光显微镜下跟踪自噬的潜力,同时使用EGFP-CD63同时标记晚期内体和溶酶体。单丹磺酰基尸胺仅标记酸性CD63阳性细胞隔,以响应各种活细胞或固定后细胞中的一系列自噬诱导物,在自噬体形成被禁用的atg5(+/+)和atg5[-/-)MEF中染色相同。单丹磺基尸胺染色与LysoTracker Red、LAMP-1或LAMP-2基本上无法区分。相反,60-90%的EGFP-LC3阳性点状细胞器未与LAMP-1/LAMP-2/CD63共定位,呈单丹酰卡达韦阴性,而与LAMP-1/LAMP-2/CD63共定位的EGFP/LC3点状细胞也呈单丹酰卡达韦阳性。因此,单丹酰尸胺与其他酸性室标志物没有区别,不能用于跟踪自噬体的形成。相反,mRFP-LC3标记的自噬体与EGFP-CD63阳性内体和溶酶体的融合,以及dsRed标记的线粒体通过EGFP-LC3-和EGFP-CD 63阳性腔室的隔离可以实时显示。此外,通过免疫印迹追踪EGFP-LC3-I(45 kDa)到EGFP-LC3-II(43 kDa。荧光LC3和反荧光内体/溶酶体蛋白的使用清楚地允许在整个自噬过程之后进行高保真的活细胞成像。

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