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.2006年7月1日；66(13):6722-31.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-3758。

蛋白激酶酪蛋白激酶2通过血清因子介导头颈鳞癌细胞中抑制因子-kappaB激酶和异常核因子-kapbaB活化

明宇（Ming Yu） 1, 叶屿生, 卡特·范·韦斯
附属公司

蛋白激酶酪蛋白激酶2通过血清因子介导头颈鳞癌细胞中抑制因子-kappaB激酶和异常核因子-kapbaB活化

明宇（Ming Yu）等。 癌症研究. .

摘要

我们之前已经证明，在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，信号转录因子核因子-κB（NF-kappaB）被异常激活，抑制NF-kapbaB可诱导细胞死亡并抑制肿瘤发生。因此，识别NF-kappaB活化的特异性激酶可以为选择性治疗提供靶点。抑制剂-κB（IkappaB）激酶（IKK）通过诱导NH（2）末端磷酸化及其内源性抑制剂Ikappa B的降解来激活NF-κb。先前报道酪蛋白激酶2（CK2）在HNSCC细胞中过度表达，是一种COOH末端的IKK，但其与HNSCC中NF-kappaB活化的关系尚不清楚。在本研究中，我们在体外检测了IKK和CK2在HNSCC中对NF-κB调节的作用。IKK1和IKK2亚单位的激酶缺失突变体或针对CK2β亚单位的小干扰RNA可特异性抑制NF-kappaB的激活。CK2和IKK激酶活性以及NF-kappaB转录活性显示为血清反应性，表明这些激酶在体外介导NF-kapbaB对血清因子的异常激活。重组CK2alpha可磷酸化重组IKK2，并促进来自HNSCC的免疫沉淀IKK复合物磷酸化IkappaBalpha的NH（2）末端S32/S36。我们的结论是，HNSCC细胞对血清的异常NF-kappaB活性部分是通过一种涉及CK2介导的IKK2激活的新机制，使这些激酶成为选择性治疗HNSCC NF-kapbaB通路的候选靶点。

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数字

图1
图1。UM-SCC细胞中NK-κB异常激活
A.NF的电迁移率变化分析-κB DNA结合活性图中所示的HEKa和UM-SCC细胞系按照方法进行培养。使用每个细胞系的5μg核提取蛋白与含有NF-κB反应元件的放射性标记寡核苷酸结合。与HEKa细胞相比，在大多数UM-SCC细胞中检测到NF-κB反应元件DNA结合活性的可变增加。自由探针作为阴性对照。野生型和突变型冷寡核苷酸与UM-SCC-5核提取物孵育，作为NF-κB反应元件特异性结合对照。叠加图中显示了作为核提取物完整性和负载控制的十月。B.核燃料-κUM-SCC细胞的B报告活动。通过与pNF-κB共转染细胞来测定NFκB报告活性-顺式-含有5x NF-κB增强子共识元件的荧光素酶报告质粒。此处所示的NF-κB报告活性代表多个测量值的平均值，这些测量值被标准化为UM-SCC-6细胞活性的百分比。此处显示的细胞系包括所示的UM-SCC1、6、9、11A和11B。优化转染条件，使每个细胞系的转染效率达到90%以上，转染效率由组成型CMV启动子控制的β-半乳糖苷酶基因决定（下图）。观察到可变NF-κB报告活性。与其他细胞系相比，UM-SCC-6细胞的NF-κB报告活性显著升高（p<0.01），而UM-SCC-9细胞的NFκB报道活性显著降低（p<0.01）。C.一κB类α环己胺处理后UM-SCC-6和-9细胞的表达和降解时间进程。如图所示，用50μg/ml环己酰亚胺处理细胞0.5至4小时。通过免疫印迹分析检测IκBα的蛋白水平，并将其归一化为膜上检测到的总蛋白♦UM-SCC-6、UM-SCC-9小区。数据表明，UM-SCC-6细胞的IκBα蛋白水平是UM-SCC-9细胞的1.8倍，IκA的半衰期为1.5小时，是UM-SCC-9细胞半衰期的一半（3小时）。D.UM-SCC-6和-9细胞IKK激酶活性的比较。来自UM-SCC-6和−9细胞的细胞裂解物被NEMO免疫沉淀。IKK激酶活性测定为纳入[33]使用N末端IκBα-GST融合蛋白作为底物（WT）获得P-IκB-α。结果通过总IκBα和从同一膜检测到的IKK2蛋白进行标准化。使用突变的S32G/S36A N-末端IκBα-GST融合蛋白作为阴性对照（Mut）。数据表明，UM-SCC-6（SCC-6）细胞的IKK激酶活性比UM-SCC-9（SCC-9）细胞高一倍。检测到的凝胶条带和这些条带强度的相应测量值分别显示在图表和表中。
图2
图2。IKK突变体对NF-κB报告活性的影响
如图所示，将UM-SCC-6细胞与pNF-κB-荧光素酶质粒和一种pcDNA3-IKK载体（IKK1–AA=S176A/S180A；IKK1-EE=S176E/S180E；IKK1–KA=K44A，IKK1-WT=野生型；IK2–AA=S177A/S181A；IKK2–EE=S177E/S181E；IKC2–KA=K44A、IKK2–WT=野生型）共转染24小时。pCK用作阴性对照。NF-κB活性归一化为pCK。。A、 IKK2对NF-κB报告子活性的影响；B、 IKK1对NF-κB报告活性的影响。IKK1和IKK2的野生型（IKK1-WT，IKK2-WT）和显性阳性（IKK1-EE，IKK1-EE）都增强了NF-κB报告活性（IK1-WT对未治疗对照组p<0.05，IKK-EE，IKK2-WT和IK2-EE对其相应的未处理对照组p<0.001）。激酶死亡的IKK2–KA抑制约65%的构成性NF-κB报告活性（p<0.001）。显性负信号突变体IKK2–AA对NF-κB活性无抑制作用（p>0.10）。激酶死亡的IKK1-KA抑制约50%的NF-κB活性（p<0.001）。激酶死亡的IKK1–AA几乎没有抑制作用，但有增强作用（p<0.05）。
图3
图3。CK2负责UM-SCC细胞的异常NF-κB活性
A.芹菜素抑制异常NF-κUM-SCC细胞的B报告活性。UM-SCC-6、9、11A和11Bc（c）如图所示，在DNA转染NF-κB荧光素酶报告分析之前，细胞暴露于100μM Apigenin 2小时。将每个细胞系的报告活性归一化为相应的未经治疗的对照细胞（开放柱，对照；固体柱，Apigenin）。数据表明，Apigenin抑制UM-SCC-6细胞约90%的NF-κB报告活性（p<0.005）和UM-SCC-9细胞约70%的NF-kb报告活性（p<0.05）。UM-SCC-11A（p<0.005）和UM-SCC.11B细胞的NF-κB报告活性也分别降低了90%和80%（p<0.05）。B和C，CK2βsiRNAs可降低UM-SCC-6和UM-SCC-9细胞中的mRNA水平。如图所示，用CSNK2B（CK2β）、扰乱或通用对照siRNA转染UM-SCC-6和-9细胞24、48和72小时。未经处理，无siRNA转染；Ambion的Ctrl-Universal、Universal阴性对照siRNA；CK2βsiRNA的Ctrl-Scramble、隐形加扰siRNA控制；CSNK2B，siRNA特异性靶向CK2βmRNA。数据显示两种细胞系CK2β的mRNA水平均随时间而降低（UM-SCC-6，p<10−9; UM-SCC-9细胞，p<10−5).D和E.CK2βsiRNA抑制异常NF-κUM-SCC细胞中的B活性。如图所示，在NF-κB荧光素酶报告试验转染前48小时，用靶向CK2β亚单位的siRNA和对照siRNA转染细胞。D.UM-SCC-6细胞的NF-κB报告活性；E.UM-SCC-9细胞的NF-κB报告活性。CK2βsiRNA显著降低UM-SCC-6细胞NF-κB报告活性（90%）（p<0.05）~UM-SCC-9细胞的NF-κB报告活性降低了60%，但这种变化在统计学上并不显著。前CK2βsiRNA抑制内源性NF的表达-κB诱导基因IκB类αUM-SCC细胞中的NFKB2/p100。48小时后，从未经处理的UM-SCC-6细胞（开条）的细胞裂解液和转染了靶向CK2β亚单位的siRNA（斜切条）以及干扰控制siRNA（实心条）的单元格中分离出信使RNA。如图所示，使用Quantigene试剂盒对IκBα和NFKN2/p100的mRNA进行定量。将数据归一化为同时检测到的相应18SrRNA水平。数据显示IκBα显著降低（p<10−6)和NFKB2/p100（p<10−7)在CK2βsiRNA转染细胞中与相应的干扰对照进行比较。
图4
图4。CK2和IKK介导UM-SCC细胞对血清的NF-κB反应
A.异常NF-κB报告活性取决于FBS的热敏成分如图所示，UM-SCC-6、9、11A和11B细胞在含有10%非热失活FBS（FBS-NHI■）、10%热失活BFS（FBS HI▩）的MEM中培养，切换到补充的无血清MEM培养基（SFM-new⬚），或在转染NF-κB报告活性之前适应于SFM（SFM-Adp▥）。NF-κB报告活性水平被归一化为相应的FBS-NHI水平。ANOVA分析和Student-Newman-Keuls分析对每个治疗组进行了比较。与FBS-NHI条件下的细胞相比，在SFM-new和FBS-HI条件下培养的细胞NF-κB报告活性降低。对SFM的适应进一步降低了UM-SCC-6、11A和11B细胞中NF-κB报告活性的95%和UM-SCC-9细胞中的83%（p<0.01）。SFM-adp的NF-κB报告基因活性水平显著低于SFM-new和FBS-HI（p<0.01）。在SFM-new和FBS-HI之间没有检测到统计学上的显著差异。B.在SFM或FBS中培养的细胞中CK2激酶活性的比较。使用在SFM（SFM）或FBS（FBS）中培养的UM-SCC-6细胞的总细胞裂解物进行CK2激酶分析。以重组活性CK2（active CK2）作为阳性对照。100μM Apigenin用于分离与每种条件平行的反应（固体，Apigenine）。在SFM中培养的细胞的CK2活性（open，Ctrl）降低到FBS中约50%（p<0.001）。用芹菜素（apigenin）处理的细胞裂解液使每个裂解液的相应CK2活性降低了约75%的FBS和约50%的SFM（p<0.05）。C.CK2的比较β细胞中的表达水平。如图所示，比较FBS-NHI或SFM-adp中生长的UM-SCC-6细胞和FBS-NHI-UM-SCC-9细胞的CK2βmRNA水平。使用Quantigene试剂盒方法测量CK2βmRNA表达水平，如图3F所示。数据显示，与FBS控制的UM-SCC-6细胞相比，SFM处理的UM-SCC-6细胞和UM-SCC-9细胞中CK2βmRNA的减少具有统计学意义（SFM和UM-SCC-9细胞分别为p<0.01和p<0.001）。D.比较在SFM或FBS中培养的细胞的IKK激酶活性。UM-SCC-6细胞在SFM或FBS中培养。IKK复合物由抗NEMO抗体从每种培养物的200μg全细胞裂解液总蛋白中IPK。以N端72个氨基酸IκBα-GST融合蛋白为底物，IκB-α-GTS融合蛋白的S32G/S36A突变体为阴性对照，测定IKK激酶活性。量化的总IKK激酶活性表示为33-磷酸化-IκBα-GST的放射活性通过放射自显影术定量到同一凝胶上定量的总-Iκ）Bα-GTS蛋白水平，以获得总IKK激酶活性，并进一步归一化到同一硅胶上IK2}的总蛋白水平。观察到这些细胞的标准化IKK激酶活性降低了60%。重组活性IKK2用作阳性对照（数据未显示）。检测到的凝胶条带和这些条带强度的相应测量值分别显示在条形图和表中。
图5
图5。CK2促进IKK激酶活性
A.IKK2是CK2的基板。如图所示，rIKK2在不含（−）或含有0.5（0.5）和5ng（5）rK2α和5ng rCK2α以及40μM芹菜素（5+芹菜素）的情况下，在含有[33]P-GTP随后进行SDS-PAGE凝胶分离、转移、放射自显影和免疫印迹分析，以检测磷酸化的IKK2和IK2α的蛋白水平。IKK2活性的CK2磷酸化表示为放射自显影检测到的辐射活性，并归一化为膜上检测到的IKK1蛋白水平。数据显示，IKK2的CK2α剂量依赖性磷酸化，芹菜素完全抑制了这种作用。B.CK2促进IKK激酶活性将具有催化活性的rCK2α（0.5ng（CK2 0.5ng）或5ng（CK2-5ng））和5ng的rCKα与40μM芹菜素（CK2 5ng+芹菜素）分别与UM-SCC-6细胞裂解液免疫沉淀的IKK复合物孵育。在IKK激酶检测之前，rCK2α被洗去。一部分未经处理的IKK复合物用作阴性对照（Ctrl）。使用与图4D中相同的底物测量IKK激酶活性。定量的总IKK激酶活性如图4D所示。与未经处理的对照组相比，分别用0.5ng和5ng rCK2α预孵育的IKK复合体的总IKK激酶活性增加了13%和60%。40μM anpigenin完全抑制rCK2α诱导的IKK激酶活性。检测到的凝胶条带和这些条带强度的相应测量值分别显示在图表和表中。
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参考文献

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