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.2006年7月21日；313(5785):324-8.
doi:10.1126/science.1129462。 Epub 2006年6月22日。

在帕金森病模型中，Alpha-synuclein阻断ER-Golgi通信，Rab1拯救神经元丢失

安东尼·A·库珀 1, 亚伦·D·吉特勒, 阿尼尔·卡西卡, 科尔·海恩斯, 凯瑟琳·希尔, 布宾德·布勒, 刘康宁, 徐克祥, 凯瑟琳·斯特拉森, 刘芳, 曹松松, 金·A·考德威尔, 盖伊·A·考德威尔, 杰拉尔德·马西施基, 理查德·科洛德纳, 约书亚·拉巴尔, 让-克里斯托弗·罗切特, 南希·博尼尼, 苏珊·林德奎斯特
附属公司

在帕金森病模型中，Alpha-synuclein阻断ER-Golgi通信，Rab1拯救神经元丢失

安东尼·A·库珀等。 科学类. .

摘要

α-突触核蛋白（Alpha-synuclein，alphaSyn）错误折叠与几种破坏性神经退行性疾病有关，包括帕金森氏病（Parkinson’s disease，PD）。在酵母细胞和神经元中，αSyn的积累具有细胞毒性，但对其正常功能或病理生物学知之甚少。酵母中alphaSyn表达后最早的缺陷是内质网（ER）-高尔基体囊泡运输的阻塞。在全基因组筛选中，最大的一类毒性调节剂是在同一步骤中发挥作用的蛋白质，包括与细胞质alphaSyn内含物相关的Rab鸟苷三磷酸酶Ypt1p。哺乳动物YPT1同源物Rab1的高表达可防止帕金森病动物模型中αSyn诱导的多巴胺能神经元丢失。因此，联核蛋白病可能是由于与特定神经元的独特生物学相结合的基本细胞功能中断而导致的，使其特别脆弱。

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图1
图1
αSyn的表达导致细胞死亡和内质网应激，并损害ERAD(A类)α-Syn诱导期间的存活曲线。诱导αSyn-WT、αSyn-A53T表达或对照细胞（载体）后，光密度为600 nm（OD）的细胞600纳米)其中1只按所述方法收获和处理（24）。测定集落形成单位并转换为相对百分比。(B类)α-Syn诱导期间的生长曲线。导入后，OD600纳米在指定的时间对每个样品进行测量。(C类)在指定的时间收获诱导表达αSyn-WT、αSyn-A53T的细胞或对照细胞（载体）；然后确定UPR激活水平并绘制为内质网应力的相对单位。Deg1-βGal的降解速率(D类)，第61-2p节(E类)和CPY*(F类)αSyn-WT或αSyn-A53T表达6小时后，通过脉冲相免疫沉淀法测定（24），并与对照细胞（载体）进行比较。
图2
图2
αSyn的积累会严重阻碍早期分泌途径中的囊泡运输。贩运CPY(A类和B类)和ALP(C类和D类)在脉冲相免疫沉淀指示的时间，在表达αSyn-WT或αSyn-A53T的细胞中进行监测，并与对照细胞（载体）进行比较。(B类)ER中剩余CPY量的图形表示[p1/（p1+p2+mCPY）]。(D类)ER中剩余ALP量的图形表示[p1/（p1+p2+mALP）]。对于CPY，p1是内质网形式，p2是高尔基体形式，m是成熟的液泡形式。对于ALP，p是内质网络形式，m则是成熟的空泡形式。
图3
图3
质粒过表达筛查确定ER-Golgi贩运基因是α-Syn毒性的修饰物。(A类)来自α-Syn改性剂屏幕的代表板（24）。在半乳糖诱导启动子的控制下，分别用3000个随机ORF转化αSyn-expressing细胞。转化子生长在含有葡萄糖（对照，αSyn“off”）或半乳糖（诱导αSyn和候选ORF的表达，αSyn“on”）的合成培养基上。强毒性和中度毒性抑制剂的示例分别显示为黑色和蓝色圆圈。α-Syn诱导毒性增强剂的示例显示为红色圆圈，进一步分析后未再现的假阳性示例显示为黄色圆圈。(B类)斑点试验表明ER-Golgi贩运基因的过度表达YPT1型,YKT6公司,短纤维5,UBP3号机组、和ERV29型抑制α-Syn诱导的毒性，而GYP8公司和PMR1（PMR1）过度表达会增强毒性。(C类)毒性抑制特定于通过以下方式促进的运输步骤YPT1型，因为其他Rab GTPase的过度表达对生长没有影响。
图4
图4
αSyn诱导的细胞毒性和囊泡转运缺陷被ER-Golgi转运成分修饰。CPY在表达αSyn-WT和携带半乳糖诱导型的细胞中的运输GYP8公司(A类和B类)，半乳糖诱导YPT1型（A和B），或SLY1-20型(C类和D类)在诱导7小时（C和D）或8小时（A和B）后通过放射标记进行监测，并与对照细胞的贩运（载体）进行比较。（B和D）ER中剩余CPY量的图形表示[p1/（p1+p2+mCPY）]。(E类)在αSyn诱导6小时后，通过荧光显微镜和间接免疫荧光显微镜检查表达αSyn-WT-GFP（绿色荧光蛋白）和HA（血凝素）-Ypt1p的细胞。
图5
图5
Rab1的表达可挽救PD动物模型中DA神经元的丢失(A类到C类)中的研究果蝇属. (A类和B类)苍蝇脑免疫染色显示TH突显DA神经元；Rab1可以完全防止DM1簇中TH免疫染色的选择性丢失。反式到+或UAS-Rab1中的基因型TH-GAL4 UAS-αSyn。(C类)DM1簇中TH阳性神经元的定量。野生型（αSyn）或突变型（A53T）αSyn导致TH丢失，而Rab1可阻止TH丢失。基因型：TH-GAL4/+（野生型）、TH-GAL4 UAS-αSyn或TH-GAL4UAS-A53T转为+或UAS-Rab1（两个独立系）。（*）数值与αSyn或A53T显著不同，P（P）<0.00001，学生t吨测试。(D类)DA毒性秀丽线虫，反映为P中头部感觉器（CEP）神经元突起的退化日期-1：：GFP+P日期-1：：αSyn在7天阶段。箭头突出显示了剩余的单个CEP进程。(E类)P中完整的DA神经元日期-1：：GFP+P日期-1：：αSyn+P日期-1：：7天阶段的Rab1。(F类)在三个独立的转基因株系中，定量Rab1对αSyn诱导的神经元丢失的修复。（**）与α，P（P）<0.05，学生的t吨测试。比例尺：20μm。(G公司)大鼠中脑初级神经元的研究。Rab1保护初级DA神经元免受αSyn-A53T诱导的毒性。用编码αSyn-A53T的慢病毒或αSyn-A53T加β-Gal（LacZ）或αSyn-A53T加Rab1的慢病毒转导原代中脑培养物。对照细胞在无慢病毒的情况下培养。免疫细胞化学评价DA细胞选择性死亡。存活率表示为MAP2阳性神经元中TH阳性神经元的百分比（三个独立实验，每个实验对每个条件至少计数100个细胞）。数据表示为平均值±SD，n个=3个实验***P（P）<0.01，采用Newman-Keuls后验进行方差分析。
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