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.2006年8月；17(8):3521-33.
doi:10.1091/mbc.e05-10-0946。 Epub 2006年6月14日。

异质核核糖核蛋白（hnRNP）E1与hnRNP A2结合并抑制A2反应元件mRNA的翻译

琳达·D·科斯托科 1, 迈克尔·马吉平托, 乔治·科尔扎, 李佐元（Joo Won Lee）, 约翰·H·卡森, 伊丽莎·巴巴拉斯
附属公司

异质核核糖核蛋白（hnRNP）E1与hnRNP A2结合并抑制A2反应元件mRNA的翻译

琳达·D·科斯图尔科等。 分子生物学细胞. 2006年8月.

摘要

异质核核糖核蛋白（hnRNP）A2是一种反式作用的RNA-结合蛋白，可介导含有顺式A2反应元件（A2RE）的RNAs的转运。先前的研究表明，A2RE RNA被转运到少突胶质细胞的髓鞘和神经元的树突。hnRNP E1是一种调节特定mRNA翻译的RNA结合蛋白。这里，我们通过酵母双杂交分析、体内和体外共免疫沉淀、体外交联和荧光相关光谱显示，hnRNP E1与hnRNP A2结合，并以hnRNP A2-依赖的方式招募到A2RE RNA。hnRNP E1与少突胶质细胞树突颗粒中的hnRNP A2和A2RE mRNA共定位。在神经细胞中过度表达hnRNP E1或微量注射外源性hnRNP El会抑制A2RE mRNA的翻译，但不会抑制非A2RE RNA的翻译。在体外翻译系统中添加过量的hnRNP E1会以hnRNP A2依赖的方式降低A2RE mRNA的翻译效率，但不会降低非A2RE RNA的转换效率。这些结果与一个模型一致，即hnRNP E1通过与hnRNP A2结合而被招募到A2RE RNA颗粒中，从而在颗粒转运过程中抑制A2RE RNA的翻译。

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数字

图1。
图1。
hnRNP E1–hnRNP A2交互。（A） 协同免疫沉淀：体外翻译产物。体外合成[35S] 甲硫氨酸标记的hnRNP A2与5倍摩尔过量的hnRNP A2-HA或hnRNP E1-25-HA组合，并用抗HA抗体沉淀混合物。沉淀用SDS-PAGE分离；将凝胶固定、干燥并暴露在x射线胶片上。（B） 协同免疫沉淀：体内内源性产物。少突胶质细胞匀浆与兔抗hnRNP E1或正常兔血清（NRS）孵育。免疫沉淀物用蛋白A结合琼脂糖珠分离，用SDS-PAGE分离，并用小鼠抗hnRNP A2进行蛋白质印迹分析，以检测hnRNP A2。右通道是免疫沉淀前的一份匀浆。（C） 生物素转移试验：将与磺化-SBED偶联的hnRNP A2（A2）与hnRNP E1（E1）、BSA或不加任何添加剂混合，并进行（+）或（-）UV交联。还原后，用SDS-PAGE分析蛋白质混合物，将其印在PVDF膜上，并用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（top）进行检测。通过SDS-PAGE分析相应的部分，并用考马斯蓝（底部）染色。分子量标记显示在左侧。
图2。
图2。
通过互相关FCS分析hnRNP E1到A2RE RNA的hnRNP A2依赖性招募。用Alexa Fluor 647标记的重组hnRNP E1在存在（闭合圈）或不存在（开放圈）未标记的hnRNP A2（10 nM）的情况下与含有12份A2RE序列（5 nM）拷贝的合成RNA孵育。在存在（闭合三角形）或不存在（开放三角形）未标记hnRNP A2（10 nM）的情况下培养类似标记的hnRNP E1，对照非A2RE RNA（5 nM）用Alexa Fluor 488标记。包括未标记tRNA（250 nM）以减少非特异性结合。通过双通道交叉相关FCS测定hnRNP E1向RNA的招募。
图3。
图3。
HnRNP E1/E2与A2RE RNA颗粒的相关性。培养的少突胶质细胞经CSK提取、固定，并用小鼠抗hnRNP A2（1:200）（绿色通道）（A）和兔抗hnRNP1/E2（1:50）（红色通道）（B）进行免疫染色。插入B中，树突远端的高倍放大。黄色表示绿色和红色强度的空间重合。将培养的少突胶质细胞微量注射荧光标记的A2RE RNA（绿色）（D），并用抗hnRNP E1/E2（红色）（E）染色。插入D中，树突中间部分的高倍放大。测量每个通道（A和B、D和E）中分辨率良好的颗粒的荧光强度，并根据代表性实验绘制（分别为C和F）。每个点代表一个颗粒。棒材，15μm。
图4。
图4。
hnRNP E1过度表达对翻译的影响。（A） 注射GFP-A2RE RNA的B104细胞。（B）注射hnRNP E1 cDNA和GFP-A2RE RNA的B104细胞。（C）注射GFP-A8G RNA的B104细胞；（D） B104细胞注射hnRNP E1 cDNA和GFP-A8G RNA。所有RNA均为聚腺苷酸，所有注射混合物均含有Alexa Fluor 546-共轭葡聚糖。新合成的GFP在绿色通道中可见，Alexa Fluor 546共轭葡聚糖在红色通道中可见。测定并绘制每个细胞的每个通道中的平均强度。每个点代表一个单元格。显示了一个代表性实验，其中分别在A、B、C和D中分析了68、63、48和64个细胞。
图5。
图5。
添加hnRNP E1对体内翻译的影响。对照组B104细胞同时注射A2RE-GFP RNA和BSA（A）、GFP-A2RE RNA和hnRNP E1（B）、GFP-A8G RNA和BSA（C）以及GFP-A8G RNA和hnRNP-E1（D）。所有RNA均为聚腺苷酸，所有注射混合物均含有Alexa Fluor 546共轭右旋糖酐。新合成的GFP在绿色通道中可见，Alexa Fluor 546共轭葡聚糖在红色通道中可见。（D） 测定并绘制每个细胞的每个通道中的平均强度。每个点代表一个单元格。有代表性的实验显示有43、52、36和28个细胞，分别在A、B、C和D中进行分析。向B104细胞注射Cy-5标记的GFP-A2RE RNA（E，a和d）、Cy-5标签的GFP-A2 RE RNA和hnRNP E1（E，b和E）、Cy-5标记的GFP-A2RE和RNA酶a（E，c和f），并在注射后30分钟（E，a-c）和6小时（E，d-f）进行成像。计算细胞核和细胞质中平均荧光强度的比值（F）。在这两个时间点，单独注射RNA和带有hnRNP E1的RNA的细胞的核质比显著小于注射RNA和RNA酶的细胞。显著性评估为p<0.01。
图6。
图6。
hnRNP E1对体外翻译的影响。（A） 在没有或存在hnRNP E1（50、100、600或1200 nM）的情况下，GFP-A2RE RNA（150 ng）在RRL中翻译。（B） GFP-A2RE RNA（150 ng）在hnRNP A2（100 nM）存在和hnRNP E1（50、100、600或1200 nM）不存在或存在的情况下翻译。荧光素酶RNA（对照）（250 ng）和GFP-A2RE RNA（150 ng）在hnRNP A2（100 nM）存在和hnRNP E1（100、200、600或1200 nM）不存在的情况下一起翻译。（C） GFP-A8G RNA（150 ng）在hnRNP A2（100 nM）存在和hnRNP E1（50、100、600或1200 nM）不存在或存在的情况下翻译。（D） GFP和荧光素酶的合成量在免疫检测后进行量化，在不添加任何裂解物的情况下用RNA产生的量被设置为代表100%的翻译效率。条形图表示标准偏差。（E） 用兔抗hnRNP E1进行SDS-PAGE和Western blot检测。1号车道，RRL；车道2，rhnRNP E1；通道3，含有150 ng A2RE RNA的RRL抗hnRNP A2免疫沉淀物；通道4，含有150 ng A2RE RNA和重组hnRNP A2（rhnRNP A2）的RRL抗hnRNP A2-免疫沉淀（100 nM）；通道5、含有150 ng A2RE RNA的RRL免疫沉淀、重组hnRNP A2（100 nM）和重组hnRNP-E1（1200 nM）；和通道6，重组hnRNP A2（100 nM）和重组hnRNP-E1（1200 nM）在盐水中的抗-hnRNP A2免疫沉淀。
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