Leukemia-associated mutations within the NOTCH1 heterodimerization domain fall into at least two distinct mechanistic classes

doi:10.1128/MCB.01655-05

.2006年6月；26(12):4642-51.

doi:10.1128/MCB.01655-05。

NOTCH1异二聚体结构域内的白血病相关突变至少可分为两类不同的机制

迈克尔·马利基¹, Cheryll Sanchez Irizarry谢丽尔·桑切斯·伊里扎里, 詹妮弗·米切尔, 加文·希斯滕, Mina L Xu（徐敏娜）, 乔恩·C·阿斯特, 斯蒂芬·布莱克洛

附属公司

PMID： 16738328
预防性维修识别码：项目经理1489116
内政部： 10.1128/MCB.01655-05

NOTCH1异二聚体结构域内的白血病相关突变至少可分为两类不同的机制

迈克尔·马利基等。分子细胞生物学. 2006年6月.

.2006年6月；26(12):4642-51.

doi:10.1128/MCB.01655-05。

作者

迈克尔·马利基¹, 谢丽尔·桑切斯·伊里扎里, 詹妮弗·米切尔, 加文·希斯滕, 米娜·L·徐, 乔恩·C·阿斯特, 斯蒂芬·布莱克洛

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿Brigham and Women's Hospital和哈佛医学院病理科，邮编02115。

PMID： 16738328
预防性维修识别码：项目经理1489116
内政部： 10.1128/MCB.01655-05

摘要

NOTCH1受体在其成熟过程中被furin在其胞外区内裂解，产生两个亚单位，它们由膜旁异二聚体（HD）结构域非共价结合在一起。正常的NOTCH1信号是通过配体与细胞外亚单位的结合而启动的，这使得跨膜亚单位容易受到金属蛋白酶和γ-分泌酶分别催化的异二聚体结构域内和C末端的两次连续裂解。由于NOTCH1异二聚体结构域突变在人类T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中频繁发生，我们评估了16种假定的肿瘤相关突变对NOTCH1信号传导和HD结构域稳定性的影响。我们在这里显示，16个突变中的15个激活了典型的NOTCH1信号。信号的增加以配体依赖的方式发生，需要γ-分泌酶活性，并与金属蛋白酶裂解敏感性增加相关。激活突变导致可溶性NOTCH1异二聚体更容易解离，无论是在天然条件下（n=3）还是在尿素存在下（n=11）。一个突变，即在金属蛋白酶裂解位点的N端插入14个残基，比其他突变更能提高金属蛋白酶的敏感性，尽管相比之下对异二聚体稳定性的影响可以忽略不计，表明插入可能通过相对于保护性NOTCH1外结构域残基重新定位S2位点而暴露S2位点。总之，这些研究表明，白血病相关的HD结构域突变通过两种不同的机制使NOTCH1对配体依赖性蛋白水解激活敏感。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
NOTCH1表达结构。（A）人类NOTCH1受体示意图。N个^{欧盟委员会}，NOTCH1细胞外亚单位；N个^TM（TM），NOTCH1跨膜亚单位；LNR，包含三个LIN12/Notch重复序列的结构域；HD，异二聚体结构域；HD-N，HD域的N-末端区域；HD-C，HD域的C末端区域；TM，跨膜段；ICN，细胞内NOTCH1；RAM，RAM域；ANK，锚蛋白重复结构域；TAD，交易激活域；PEST，PEST域；S1，呋喃解理位点。本文描述了16种白血病衍生HD结构域突变。（B）这些研究中使用的NOTCH1多肽。

**图2。**
各种NOTCH受体HD结构域的序列比对。序列中相同和保守的残基分别封装在黄色和灰色框中。h、人；x、，爪蟾; m、小鼠；还有斑马鱼zf。Furin（S1）和金属蛋白酶（S2）的裂解位点显示在序列下方。经分析的白血病衍生突变在序列上方被识别。

**图3。**
HD域突变导致NOTCH1信号的激活。HD域突变被引入（A）全长或（B）ΔEGF NOTCH1结构体。对U2OS细胞裂解物进行荧光素酶分析，该细胞裂解物由三份转染的细胞制备，其中含有10 ng空pcDNA3质粒或编码（A）全长或（B）ΔEGF NOTCH1指示形式的质粒，以及含有重复CSL结合位点的荧光素素酶报告质粒和表达*雷尼利亚*荧光素酶。一式三份测量来自细胞裂解物的萤火虫萤光素酶活性，将其标准化，并相对于从用空载体转染的细胞制备的提取物中的活性进行表达，该空载体的值任意设置为1。突变L1575P和L1601P之前被证明在全长NOTCH1（48）的背景下刺激信号传导，也在ΔEGF的背景下激发信号传导（数据未显示）。

**图4。**
HD结构域突变导致S2和S3分裂增加。（A） γ分泌酶抑制剂（GSI）治疗可消除全长NOTCH1中HD域突变的刺激效应。将编码所示突变的NOTCH1表达质粒转染U2OS细胞后，立即用1μM化合物E（GSI）或载体单独处理细胞。如图3图例所示，转染后44至48小时进行转录激活分析。在其他实验中，GSI也抑制了L1575P突变产生的增加信号（数据未显示）。（B）收获前，将转染野生型ΔEGF-MYC NOTCH多肽的U2OS细胞在1μM化合物E（GSI；+）或载体（−）存在下培养18小时。N个^TM（TM）和N^TM（TM）*然后，通过使用抗MYC偶联珠从细胞裂解液中制备免疫沉淀物来回收多肽，在还原条件下通过SDS-PAGE进行拆分，并使用细胞内NOTCH1抗体通过Western blotting进行检测。（C）将HD域突变引入ΔEGF-MYC多肽，并进行相同的检测。前体，未分离NOTCH1多肽；N个^TM（TM），S1位点furin裂解产生的跨膜亚基；和N^TM（TM）*，S2裂解产物。

**图5：。**
HD结构域突变对自然条件下亚单位分离的影响。表达分泌的未突变和突变LNR-HD多肽（sHDs）的293T细胞的条件培养基用抗FLAG（α-FLAG）珠免疫沉淀（IP）（顶部两个面板），并在SDS-PAGE后用所示抗体进行Western blot分析。为了更好地衡量sHD亚基的共沉淀是否受到突变的影响，我们将一系列共沉淀的未突变sHD亚基作为对照。除sHD亚单位外，在大多数条件培养基（包括正常对照）中还检测到不同数量的未处理sHD。诱使HA标记的HD-C亚基解离的突变用恒星表示。在使用抗HA（α-HA）珠（底部一对板）制备免疫沉淀的平行实验中观察到了类似的结果，并通过Western blotting评估了FLAG标记的HD-N亚基的共沉淀。

**图6。**
尿素存在下HD结构域突变对亚单位分解的影响。表达（A）未突变分泌型NOTCH1异二聚体或（B）突变sHDs的293T细胞条件培养基用抗-HA（α-HA）偶联珠免疫沉淀，然后在室温下用不同浓度的尿素（0-4M）在缓冲液中培养30分钟。用SDS-PAGE和Western blot分析两个亚单位的抗体评估亚单位分离。α-FLAG，防FLAG。

**图7。**
白血病相关异二聚体结构域突变的拟议分类。1类突变的激活是由于异二聚体分离或异二聚物稳定性降低。1A类突变导致明显的异二聚体分离，而1B类突变通过诱导局部“呼吸”导致异二聚物分离缓慢或S2位点暴露增加。2类突变对异二聚体内的稳定性没有影响，但通过定位暴露物导致蛋白水解激活，突变相关S2位点远离保护残基，通常在配体结合前阻止金属蛋白酶进入。箭头的厚度表示通过指示步骤的分子的估计通量。HD-N，红色；HD-C，蓝色；S1位点，填充三角形；S2站点，开放三角形。底部面板中的虚线表示插入的序列，x表示插入烧蚀的原始S2位点的位置。

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