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.2006年5月22日；173(4):533-44.
doi:10.1083/jcb.200512059。

不同的p53乙酰化盒对基因表达模式和细胞命运的影响不同

乍得D骑士队 1, 杰森·卡塔尼亚, 西蒙·迪乔瓦尼, 赛琳·穆拉托格鲁, 里卡多·佩雷斯, 琥珀Swartzbeck, 安德鲁·阿昆（Andrew A Quong）, 张晓静, 特里·比尔曼, 理查德·佩塞尔, 玛丽亚·劳拉·Avantaggiati
附属公司

不同的p53乙酰化盒对基因表达模式和细胞命运的影响不同

乍得D骑士队等。 J细胞生物学. .

摘要

p53基因产物的活性受到过多翻译后修饰的调节。一个悬而未决的问题是，这种翻译后的变化是多余的还是相互依赖的。我们发现p53的特定乙酰化和磷酸化残基之间的功能性干扰影响细胞命运。赖氨酸320（K320）的乙酰化可阻止p53 NH（2）-末端区关键丝氨酸的磷酸化；只允许激活含有高亲和力p53结合位点的基因，如p21/WAF；促进DNA损伤后的细胞存活。相反，K373的乙酰化导致p53 NH（2）-末端残基的过度磷酸化，并增强与p53具有低DNA结合亲和力的启动子（如促凋亡基因中所含的启动子）的相互作用，导致细胞死亡。此外，这两个赖氨酸簇中的每一个的乙酰化都不同程度地调节p53与辅活化剂和辅抑制剂的相互作用，并产生不同的基因表达谱。通过与“组蛋白密码”假说相类比，我们提出p53的多种生物活性是由不同的“p53盒”协调和解码的，每个盒都包含翻译后修饰和蛋白质相互作用的组合模式。

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数字

图1。
图1。
K320和K373乙酰化p53对DNA损伤的反应动力学与细胞周期阻滞或凋亡相关。（A） 表达四环素诱导p53的H1299细胞的细胞周期特征。在用四环素诱导p53 24小时后，不处理细胞，或用5μM阿多泽兰素或比泽兰素处理细胞，或者用100μM足叶乙甙处理细胞。如前所述进行流式细胞术（Avantaggiati等人，1997年）。显示Sub-G1、G1、S或G2/M DNA含量的细胞百分比作为每个直方图的插图提供。（B） 按照A中每个面板顶部的指示处理表达p53的H1299细胞。在处理后的不同时间，收集细胞并用识别乙酰基p53的多克隆抗体免疫沉淀细胞裂解物K320公司（Acp53K320公司)或乙酰基-p53K373公司（Acp53K373公司)或者用抗体识别总p53，如每块面板左侧所示。然后用针对p53 NH的单克隆抗体混合物对这些反应的产物进行免疫印迹2终点（DO-1）和COOH终点（PAb421）。黑线表示中间车道已拼接。（C） 表达WT p53的H1299细胞未经处理，或用浓度增加的adozelesin或bizelesin（1、50或500μM）处理，6小时后采集，并像B中一样进行分析。
图2。
图2。
p53乙酰化突变体对细胞生长的不同影响。（A） 表达p53蛋白的H1299细胞的细胞周期曲线（显示在面板顶部）。细胞未经处理或用50μM阿多泽莱辛、50μM比泽莱辛或100μM足叶乙甙处理。在添加四环素24小时后添加药物，细胞再生长24–48小时，然后收获并用碘化丙啶（在所有面板中显示）和BrdU（未描述）染色，并测定其细胞周期曲线。（B和C）四环素诱导的H1299细胞未经处理或用1μM adozelesin处理4 h。细胞被广泛清洗并在无药培养基中培养，但在四环素存在下再培养24 h。然后去除四环素以关闭p53表达，并让细胞恢复6–8 d，然后用考马斯亮蓝（B）对一个培养皿进行染色，剩下的培养皿用于细胞计数（C）。误差条表示SEM。
图3。
图3。
辅因子与乙酰化形式的p53蛋白的相互作用。（A） 用四环素处理的H1299细胞制备的核提取物用抗Flag抗体免疫沉淀，用Flag肽洗脱，并在4–20%梯度凝胶上运行。用特异性抗体进行免疫印迹显示p300、PCAF、HDAC1和mSin3的存在。（底部）抗Flag特异性免疫沉淀中所含的总p53水平。（B） 表达天然p53的H1299细胞用足叶乙甙处理指定时间。细胞提取物用抗Acp53免疫沉淀K373公司–特异性抗体。这些反应中存在p53、SIRT1/Sir2或HDAC1，如各面板侧面所示，通过特定抗体的免疫印迹显示。底部面板代表沉淀的p53蛋白总量的～20%。（C） 分析真正乙酰化形式的p53和p300之间的相互作用。表达WT p53的A549细胞用50μM adozelesin处理16小时，用Acp53免疫沉淀K320公司（车道1）或Acp53K373公司（车道2）。对这些反应进行p53和p300特异性免疫印迹。免疫沉淀后用C-20（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）抗体测定p300的总水平，而从总提取物中检测p53水平（泳道3）。
图4。
图4。
p53乙酰化突变体诱导的基因表达模式的特征。（A） 由p53乙酰化调控的基因簇模拟。对应于折叠变化>2的探针被分层聚集。每个探针的数据都在列中，每个实验都显示为一行。红色和绿色分别表示表达水平的增加和减少，强度反映了变化的幅度。（B） 通过半定量RT-PCR验证微阵列数据。为了验证寡核苷酸微阵列结果，使用半定量RT-PCR估计WT p53–、p53Q320–和p53Q373表达细胞（+）中三个改变基因的RNA量。为了确保克隆变异不会导致不同水平的基因表达，在没有四环素（−）的情况下，从H1299-WT、-Q320和-Q373细胞中收集mRNA。使用Fluor Chem 3.04A软件（Alpha Innotech Corp.）进行密度测定，并将其归一化为β-肌动蛋白信号。折叠变化代表每个细胞系内观察到的每个mRNA的差异。在没有四环素的情况下检测到的每条谱带被赋予一个任意值1，并与在四环素存在的情况下所检测到的谱带进行比较（车道1、3和5分别与车道2、4和6进行比较）。（C） p53与来自不同启动子的DNA结合位点的体内相互作用。未经处理的H1299或用四环素处理的H129.9与甲醛交联，并用识别p53（FL393）的多克隆抗体进行免疫沉淀。将这些免疫沉淀反应中包含的p53蛋白量归一化（E），以便使用类似数量的DNA-结合的p53对p21/WAF、PIG3、BAX和p53AIP1的启动子进行序列特异性扩增。（D） 用四环素处理H1299细胞以诱导WT p53蛋白，然后进行ChIP处理。使用针对Acp53的抗体沉淀乙酰化p53K320公司或Acp53K373/K382而多克隆p53抗体沉淀了总p53。启动子结合如C中所述进行评估。输入占用于沉淀的总DNA含量的约2%。（E） 在通过直接免疫印迹进行DNA-蛋白质交联之后和免疫沉淀反应之前（未描述），预先确定用于ChIP分析的每个细胞系中的p53蛋白水平的均衡。然后根据初步评估调整细胞提取物的量，以便对每个乙酰化突变体的等量进行免疫沉淀和随后的PCR扩增。这两个面板显示了均衡后p53蛋白的典型水平，这是从两个不同的实验中得出的。（F） H1299细胞未经处理（时间0）或用四环素处理12和24小时。p53表达细胞系的类型显示在面板顶部。制备细胞裂解物，并用识别p53、p21/WAF、Bax和肌动蛋白的抗体进行免疫印迹。
图5。
图5。
乙酰亚胺Q320改变p53的核-细胞质穿梭。（A和B）四环素诱导的H1299细胞生长在玻璃盖玻片上，24小时后用抗p53多克隆抗体（红色）和DAPI（蓝色）染色A和B中的细胞。（C） 四环素诱导的表达p53Q320和p53DM的细胞在钩端霉素B存在下生长，并进行间接免疫荧光。
图6。
图6。
K320的乙酰化增加了p53的细胞质定位。（A） 四环素诱导的表达WT p53的H1299细胞未经治疗，或用50μM adozelesin处理16 h，然后用识别320-乙酰化p53（Ac-320；红色）的多克隆抗体（识别总p53（绿色）和DAPI的单克隆抗体）染色。（B） 用PCAF或p300表达载体转染WT p53–H1299细胞24小时，然后用DAPI和识别p300、p53或PCAF的抗体染色，如每个面板顶部所示。
图7。
图7。
p53乙酰化突变蛋白的磷酸化谱。（A） 从表达p53、p53Q320或p53Q373的四环素诱导H1299细胞中提取的细胞提取物用识别总p53或S15-磷酸化p53的抗体进行免疫印迹。不同细胞系之间的p53水平是相等的（底部），因此每个p53乙酰化突变体的数量相似，都可以用抗磷酸化特异性抗体进行检测。通过p53多克隆抗体免疫沉淀检测S46或S392磷酸化，然后使用针对磷酸化S46或-S392的抗p53抗体免疫印迹检测。使用Fluor Chem 3.04A软件通过密度测定法测定每个磷酸化位点的折叠诱导，表达天然p53的细胞被赋予任意值1，信号被归一化为总p53水平。（B） 从杆状病毒感染的细胞中纯化WT p53、p53Q320和p53Q373，并用不同的抗体进行免疫沉淀（IP），每个抗体识别不同的表位，浓度在每个面板顶部指示。对这些免疫沉淀产物进行免疫印迹（IB）。使用的抗体组合显示在每个面板的左侧。（C） 通过考马斯蓝染色（1）或DO-1抗体直接免疫印迹（2）观察从杆状病毒感染细胞中纯化的p53突变体。
图8。
图8。
p53盒由翻译后修饰和蛋白-蛋白质相互作用组合而成，控制细胞命运。通过与Strahl和Allis（2000）阐述的“组蛋白密码”假说相类比，并基于本研究中显示的数据，我们提出翻译后修饰的特定组合会产生独特的p53盒，将p53导向精确的细胞功能。这些p53盒除了直接影响p53的关键生化特性（如DNA结合亲和力）外，还与参与解码和引发特定反应的效应蛋白发生特异性相互作用。我们设想，这些组合盒可能存在于许多p53翻译后修饰中，并在p53的多种上游调节因子和下游事件之间建立模块化联系。
图9。
图9。
人类与人类之间K373而非K320的保护D.黑腹果蝇第53页。人类和D.黑腹果蝇使用GeneStream中的LALIGN对p53进行比对(http://www.eng.uiowa.edu（英文）/～tscheetz/序列分析/示例/LALIGN/LALIGN-guess.html). 相同的残留物用灰色表示，而保守的残留品用蓝色表示。人类p53上显示K320和K373。
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参考文献

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