In-frame deletion in a novel centrosomal/ciliary protein CEP290/NPHP6 perturbs its interaction with RPGR and results in early-onset retinal degeneration in the rd16 mouse

doi:10.1093/hmg/ddl107

.2006年6月1日；15(11):1847-57.

doi:10.1093/hmg/ddl107。 Epub 2006年4月21日。

一种新的中心体/睫状体蛋白CEP290/NPHP6的帧内缺失干扰了其与RPGR的相互作用，导致rd16小鼠早期视网膜变性

附属机构

PMID： 16632484
预防性维修识别码：项目经理1592550
内政部： 10.1093/hmg/ddl107

一种新的中心体/睫状体蛋白CEP290/NPHP6的帧内缺失干扰了其与RPGR的相互作用，导致rd16小鼠早期视网膜变性

薄昌等。人类分子遗传学. 2006.

.2006年6月1日；15(11):1847-57.

doi:10.1093/hmg/ddl107。 Epub 2006年4月21日。

附属

¹美国密歇根州04609巴尔港杰克逊实验室。

PMID： 16632484
预防性维修识别码：项目经理1592550
内政部： 10.1093/hmg/ddl107

摘要

中心体和纤毛相关蛋白在有丝分裂后细胞建立极性和调节细胞内转运方面起着关键作用。利用遗传作图和位置候选策略，我们在一个新的中心体蛋白CEP290（也称为NPHP6）中发现了一个框内缺失，导致了一个新发现的小鼠突变体rd16的早发性视网膜变性。我们证明CEP290主要定位于分裂细胞的中心体和视网膜光感受器的连接纤毛。我们发现，在视网膜中，CEP290与包括RPGR在内的几种基于微管的转运蛋白相关，RPGR在大约15%的视网膜色素变性患者中发生突变。在rd16视网膜中检测到一个截短的CEP290蛋白（DeltaCEP290），但数量显著减少；然而，突变蛋白表现出与特定RPGR同种型更强的相关性。免疫金标记研究显示RPGR和光转导蛋白在rd16视网膜光感受器中的重新分布。我们的发现表明CEP290在睫状体运输中的关键功能，并为早期光感受器变性的机制提供了见解。

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数字

图1
检查*第16行*小鼠视网膜。(A类)WT C57BL/6J小鼠和*第16行*纯合子突变体(*第16周/第16周*)1个月龄和2个月龄时出现视网膜变性。(B类)WT和突变体的ERG反应(*rd16/rd16*)小鼠在黑暗（SCOTOPIC）和光照（PHOTOPIC。箭头表示A波，箭头表示B波。(C类)WT视网膜组织学*第16行*指定年龄的纯合子小鼠。视网膜色素上皮；OS，外段；IS，内段；ONL，外核层；外层丛状层；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。

图2
*Cep290型*中的突变*第16行*. (A类)连锁交叉数据：165个来自(*第16行*×铸件/EiJ）F1×*第16周/第16周*对ERG表型进行表型分析，并对所示微卫星标记进行基因分型。黑框表示纯合子*第16行*-衍生等位基因和白盒代表*第16行*-和CAST衍生等位基因。共享相应单倍型的动物数量显示在每列方格的下方。通过最小化交叉数来确定标记位点的顺序。这个*第16行*从显示重组的小鼠的ERG表型推断出该基因座。(B类)小鼠10号染色体遗传图显示*第16行*关键区域，与人类染色体12q21.1同源。(C类)WT小鼠视网膜中BC004690（Cep290，外显子27-48）的实时RT-PCR分析。将不同发育阶段的表达水平归一化为Hprt水平后，计算出相对于胚胎期E14的相对折叠变化。P、产后一天。每个条形代表平均值±SE(n个= 6). (D类)视网膜BC004690的实时RT-PCR分析*Crx公司^−/*⁻和编号^−/−与WT小鼠进行比较。中的表达式级别*Crx公司*^−/−和编号^−/−视网膜在正常化至*Hprt（小时）*水平。每个条形代表平均值±SE(n个= 6). (E类)RT-PCR分析（使用F2–R2引物组）*BC004690号*使用*第16行*和WT视网膜RNA。在*第16行*与WT中2.1 kb的产物相比。DNA大小标记显示在左侧（以kb为单位）。(F类)*BC004690号*中的顺序*第16行*显示包含外显子35-39的897bp的框内缺失。使用了氨基酸的三个字母代码。(克)WT和*第16行*DNA使用外显子34探针。DNA被消化*多克隆位点*在外显子34和40之间切割WT DNA五次，而在*第16行*DNA，只有三个*多克隆位点*网站仍然存在。WT DNA的预期带宽为10.6 kb，而*第16行*DNA，一条约15 kb的较重条带（箭头所示）。分子量标记以千碱为单位。(**H（H）**)的示意图*Cep290型*基因和CEP290和ΔCEP290蛋白显示假定的结构域和基序。CC，线圈；KID、RepA/Re+蛋白KID；P-loop，ATP-GTP-结合位点基序A；纺锤体结合域；MYO-尾，肌球蛋白尾同源结构域。

图3
CEP290的表达和定位。(A类)用空载体（模拟）或编码全长人CEP290蛋白并融合到myc-tag的载体转染COS-1细胞。使用抗myc（上面板）或抗CEP290抗血清（下面板），通过免疫印迹（IB）对细胞进行裂解和分析。箭头表示特定的条带。模拟转染通道（下面板）中的免疫反应带为内源性CEP290蛋白。免疫前血清未显示信号（数据未显示）。(B类)WT蛋白提取物的免疫印迹（20μg）和*第16行*使用CEP290抗体分析（200μg）视网膜。箭头表示CEP290的全长和预测的交替拼接产品。(C类)野生型小鼠视网膜的免疫组织化学分析。将切片与CEP290抗体孵育，然后进行二级抗体孵培养。（a）和（c）视网膜切片的Nomarski图像。（b）（d）CEP290抗体染色（绿色）显示连接纤毛的强烈标记（箭头所示）。还观察到IS中的标签。比例尺：（a）、（b）为40μm；（c）、（d）为10μm。(D类)在IMCD-3细胞中，CEP290（绿色）与γ-微管蛋白（红色；上图）和PCM1（红色；下图）在中心体（箭头；合并）处共定位。用双苯甲酰亚胺（BIS）对DNA进行染色。(E类)CEP290在细胞周期中与中心体相关。同步化HeLa细胞与抗γ-微管蛋白（红色）和CEP290（绿色）抗体共同染色，并通过共焦显微镜进行分析。箭头表示CEP290（合并）在所有指定的细胞分裂阶段的中心体染色。(F类)用p50-dynaminin表达载体转染IMCD-3细胞。细胞用p50（红色）、CEP290或γ-微管蛋白（绿色）抗体染色。箭头表示未转染细胞中的中心体CEP290和γ-微管蛋白，而箭头表示p50过度表达细胞中CEP290及γ-微管蛋白定位于中心体。合并图像显示蓝色细胞核染色。

图4
CEP290和ΔCEP290与视网膜中的RPGR-ORF15和其他中心体/微管相关蛋白相关。(**A、 B类**)使用ORF15执行IP^{人物配对关系}（A）来自WT的CEP290（B）抗体或正常IgG，以及*第16行*视网膜提取物（每个200μg）。免疫沉淀蛋白通过IB使用CEP290（A）或ORF15进行分析^{人物配对关系}（B）抗体。输入通道含有20%用于IP的蛋白质提取物。长时间暴露于（A）中的印迹显示ΔCEP290在*第16行*输入车道（未显示数据）。分子量标记以千道尔顿为单位。星号表示使用ORF15从WT视网膜免疫沉淀的微弱全长CEP290-免疫活性带（290kDa）^{人物配对关系}抗体。（A）中的箭头指向从*第16行*视网膜使用ORF15^{人物配对关系}.（B）中的箭头表示ORF15识别的多个RPGR-ORF15亚型^{人物配对关系}抗体（29）。CEP290抗体免疫沉淀低分子量（120–220 kDa）RPGR-ORF15亚型*第16行*. (C类)使用CEP290（绿色）和ORF15的免疫细胞化学^{人物配对关系}（红色）抗体显示内源性CEP290和RPGR-ORF15在IMCD-3细胞中的共同定位。箭头表示共同本地化（合并）。(D类)WT和*第16行*使用CEP290抗体对视网膜提取物进行IP处理，并使用指示的抗体通过IB进行分析。输入通道占IP所用总蛋白提取物的5%。分子量标记以千道尔顿为单位。车道1和2：来自WT和*第16行*视网膜提取物；3和4:IP使用来自WT和*第16行*分别为；5:IP，WT视网膜IgG正常。(E类)通过将WT视网膜的蛋白质提取物与指示的IP抗体孵育，然后使用CEP290抗体孵育IB来进行反向IP。分子量标记以千道尔顿为单位。

图5
RPGR-ORF15、视紫红质和抑制素的定位*第16行*视网膜。(**A–D**)WT的免疫金EM或*第16行*带有指示抗体的视网膜。使用ORF15标记^{人物配对关系}抗体显示RPGR-ORF15（a）的连接纤毛（CC）染色占优势，而非在整个感光细胞IS中异常广泛的标记*第16行*视网膜（B、C）。箭头表示成簇的免疫金颗粒。视紫红质的标记*第16行*视网膜（D）在感光细胞体周围明显可见（箭头所示），无专属OS定位；N、核心。(**E、 F类**)WT和*第16行*P12视网膜，在正常光/暗循环下解剖，带有抗视紫红质（E）或抑制素（F）抗体。如图所示，视紫红质和抑制素主要定位于WT视网膜的OS，而*第16行*光感受器的ONL和IS中也检测到视紫红质和抑止素。中的操作系统*第16行*视网膜在P12处退化，因此与内节（OS/IS）结合。比例尺：50μm。

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1. Doxsey S.重新评估中心体功能。Nat Rev Mol细胞生物学。2001;2:688–698.-公共医学
1. Beisson J，Wright M.基本体/中心粒组装和连续性。当前操作细胞生物学。2003;15:96–104.-公共医学
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