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.2006年4月；26(8):2965-75.
doi:10.1128/MCB.26.8965-2975.2006。

果蝇中Drosha和Argonaute蛋白调控的信使核糖核酸的全基因组分析

简·雷温克尔 1, 帕维尔·纳塔林, 亚历山大·斯塔克, 朱利叶斯·布伦内克, 史蒂芬·M·科恩, 莉莎·伊萨拉尔德
附属公司

黑腹果蝇Drosha和Argonaute蛋白调节的mRNA的全基因组分析

简·雷温克尔等。 分子细胞生物学. 2006年4月.

摘要

RNA沉默途径是一种保守的基因调控机制，可引起与短干扰RNA和微RNA（miRNAs）互补的mRNAs的衰变和/或翻译抑制。由这些途径调节的转录组的比例尚不清楚，但人们认为每个miRNA可能有数百个靶点。为了在基因组水平上鉴定沉默途径调控的转录物，我们检测了缺失四个在RNA沉默中起重要作用的Argonaute Paralog（即AGO1、AGO2、PIWI或Aubergine）的果蝇黑腹果蝇细胞的mRNA表达谱。我们还分析了缺失miRNA处理酶Drosha的细胞。结果表明，Drosha缺失细胞中差异表达的转录物在AGO1敲除中具有高度相关性表达，并在预测和验证的miRNA靶点中显著富集。miRNA靶标子集的水平也受AGO2调节。此外，AGO1和AGO2沉默了一组常见的可移动遗传元素的表达。总之，这些结果表明，果蝇AGO1和AGO2之间的功能重叠比以前认为的更重要。

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数字

图1。
图1。
的表达式配置文件果蝇属S2细胞缺乏Drosha或Argonaute蛋白。（A） S2细胞用车道上方显示的dsRNAs进行处理。通过Western blotting和左侧显示的抗体分析消耗的有效性。在泳道1至3中，加载第0天分离的样品的稀释液，以评估贫化的功效。抗核抗原REF1（α-REF1）的抗体用作负荷对照。（B） 通过RT-PCR分析PIWI耗竭的有效性。面板左侧的阳性或阴性标记表示包含或省略了逆转录酶（+RT）。rp49 mRNA起到了内部控制作用。wt，野生型。（C） 比较所有图谱中可检测转录物（5760 RNA）的平均表达水平。左边的数字表示变化(n个-fold）在表达水平。蓝色，与参考样本相比，成绩单的代表性不足至少1.5倍；黄色，成绩单没有显著变化（与参考值相差不到1.5倍）；红色，转录本至少是高代表性的1.5倍。每种蛋白质获得的独立表达谱的数量在列下方的括号中表示。星号表示来自单个击倒的轮廓。
图2。
图2。
由Drosha、AGO1或AGO2调节的RNA。（A） 在为Drosha获得的两个独立图谱中，RNA的表达谱至少为1.5倍或不足（见补充材料中的表S2）。右边的数字表示变化(n个-fold）在表达水平。（B） 在第9天为AGO1获得的六个图谱中，至少有五个图谱中RNA的表达谱高于或低于1.5倍（见补充材料中的表S3）。（C） 在AGO2的三个独立图谱中，RNAs的表达谱至少高出或低于1.5倍（见补充材料中的表S4）。在所有小组中，考虑了Drosha、AGO1-和AGO2-缺失细胞（5868个RNA）中可检测到的转录物。
图3。
图3。
miRNA通路调控的核心转录物。（A） 在Drosha和AGO1缺失（第9天）细胞（核心转录物）中，RNA的表达谱至少是过度表达的1.5倍（见补充材料中的表S6）。右边的数字表示变化(n个-fold）在表达水平。（B） S2细胞总RNA样本的Northern blot分析。使用了专用于车道上方所示miRNAs的探针。tRNA阿拉用作装载控制。（C） GO术语在核心成绩单列表中显著丰富（灰色条）。黑条表示与特定GO术语相关的可检测转录物的百分比。（D） 直方图显示了从控制细胞分离的样本中检测到的所有转录物的信号强度分布（黄色条；平均信号强度为569），以及控制细胞（红色条；平均信息强度为188）或AGO1缺失细胞（第9天）中的核心转录物列表（蓝色条；平均信号强度为465）。
图4。
图4。
核心转录物代表真正的miRNA靶点。（A和B）如图所示，在S2细胞中共转染组成性表达萤火虫荧光素酶（luc.）的报告质粒，其两侧为预测的miRNA靶点的3′UTR和表达miRNA初级转录物的质粒。雷尼利亚荧光素酶作为转染对照。萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚荧光素酶活性的三个独立实验(n个= 3). 没有miRNAs的正常萤火虫荧光素酶活性设置为100%（水平虚线）。星号表示萤火虫荧光素酶活性显著降低。在A组中，对所有预测在给定的3′UTR中具有结合位点的miRNAs进行了测试，而在B组中，每个报告者只对具有潜在结合位点的一部分miRNAs.进行了测试。（C） 在第0天和第4天用指定的dsRNAs处理S2细胞。第6天，用质粒混合物转染细胞：表达萤火虫荧光素酶（Fluc）的质粒，两侧有指示的3′UTR，表达miRNA初级转录物（灰色条）或相应的空载体（黑色条）的质粒和表达雷尼利亚荧光素酶。萤火虫和雷尼利亚转染后4d检测荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚转染空载体并用GFP dsRNA（黑条）处理的细胞的荧光素酶活性设置为100%。对于所有面板，均显示了平均值，误差条表示三个独立实验的标准偏差。
图5：。
图5：。
AGO2与miRNAs相关。（A） 从总细胞裂解物中免疫沉淀HA标记的AGO1、AGO2或MBP。右图显示免疫沉淀样品暴露时间较长，以观察AGO1的存在。α-HA，抗-HA。（B） 用Northern印迹法分析A组所示免疫沉淀物（IP）中是否存在miR-13b或bantam。
图6。
图6。
RNA只在单个敲除中受调控。仅由Drosha（A和B）、AGO1（C）或AGO2（D和E）调控的RNA在其他敲除中表现出非相关表达。（F） 仅在Drosha和AGO1（第9天）获得的四个剖面中调节RNA。左边的数字表示变化(n个-fold）在表达水平。在面板B和E中，Northern blot分析的信号归一化为rp49 mRNA或18S rRNA。将这些值与微阵列测量的值（独立剖面的平均值）进行比较。在印迹之间给出的值与模拟处理（对照）细胞获得的值有关（正值，表示过多；负值，表示不足）。
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