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。2006年3月8日；25(5):1009-23.
doi:10.1038/sj.emboj.7601016。 Epub 2006年2月23日。

受体内化在CD95信号转导中的作用

Kyeong-Hee Lee（李庆熙） 1, 克里斯汀·菲格, 弗拉基米尔·奇科夫, 罗伯特·希克尔, 科拉·哈拉斯, 斯特凡·舒茨, 马库斯·E·彼得, 安德鲁·C·陈
附属公司

受体内化在CD95信号转导中的作用

Kyeong-Hee Lee（李庆熙）等。 欧洲工商管理硕士J。 。

摘要

细胞表面CD95受体的激活触发一系列信号事件，包括组装死亡诱导信号复合物（DISC），最终导致细胞凋亡。在本研究中，我们证明了I型细胞中CD95配体介导的DISC扩增、caspase激活和凋亡对受体内化的一般要求。DISC组分向激活受体的募集主要发生在受体进入内体室后，阻断CD95内化会损害DISC的形成和凋亡。相反，不能内化CD95的细胞的CD95配体刺激会激活增殖性Erk和NF-kappaB信号通路。因此，CD95的亚细胞定位和内化途径在控制不同信号级联的激活以决定不同的细胞命运方面发挥着重要作用。

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数字

图1
图1
FynC-GFP-INP54p表达细胞中CD95内化缺陷和凋亡诱导。(A类)PM-靶向INP54p表达细胞中caspase激活缺陷。表达对照载体（泳道1-4）或FynC-GFP-IMP54p（泳道5-8）的BJAB细胞用Flag泳道-CD95L刺激指定时间。细胞被裂解并分析caspase-8（顶部）和-3（底部）的裂解。使用双重转染方案，转染效率>90%。所示数据代表了两个实验。(B类)PM-靶向INP54p表达细胞中的DISC组件有缺陷。BJAB细胞按（A）所述进行处理。CD95L–CD95复合物通过使用抗标记抗体偶联珠进行免疫沉淀，并分析相关的DISC蛋白（1-8通道）。还分析了细胞裂解液中的DISC蛋白和CD95表达（通道9和10）。所示数据代表了三个实验。(C类)瞬时转染FynC-GFP-INP54p的BJAB细胞用Flag-CD95L刺激指定时间。通过反褶积显微镜观察左侧面板中渗透细胞的GFP（绿色），并对中间面板中的CD95（红色）和F-actin（蓝色）进行染色。右侧面板显示了CD95荧光信号记录的RPV定量图像分析。红色表示最高荧光强度，蓝色表示最低荧光强度。RPV=相对像素值。所示数据代表了所分析的150多个细胞。(D类)FynC-GFP-INP54p抑制CD95内化。转染FynC-GFP（顶部）或FynC-GFP-INP54p（底部）的BJAB细胞在37°C下与Flag-CD95L孵育15（绿色）或30分钟（红色）。作为对照，用Flag-CD95L在冰上培养细胞（0分钟，黑色）。用抗CD95单克隆抗体（DX2）染色检测剩余表面CD95，并用流式细胞仪进行分析。所示数据代表了四个实验。
图2
图2
膜结合CD95L诱导CD95内化。(A类)mCD95L激活后CD95在SKW6.4细胞上的内化。SKW6.4细胞与FITC-DX2在冰上孵育。然后，细胞未经处理或与表达人mCD95L的分离CT26细胞孵育1小时。细胞核用DAPI染色，CD95用共焦显微镜观察。左下面板表示早期，细胞核完整，内含CD95小泡（箭头）。右下图显示了细胞核碎裂的细胞凋亡晚期。(B类)SKW6.4细胞上的CD95在接触侧与表达mCD95L的CT26细胞内化。将带有结合生物素标记的抗CD95单克隆抗体的SKW6.4细胞（标记为S）涂布在粘附的CT26或CT26mCD95L细胞（标记C）的顶部，并按照指示进行培养。通过链霉亲和素Alexa Flour 488染色观察CD95。DAPI染色显示细胞核。(C类)抗裂解mCD95L（DA4）激活后CD95在BJAB细胞上的内化。将BJAB细胞（标记为B）与鸡DT40细胞（标记为D）（左图）或表达人mCD95L（DA4）的DT40细胞（右图）孵育1小时，然后通过去卷积显微镜分析CD95（红色）、表面hIgM（绿色）和DAPI染色（蓝色）。(D类)抑制mCD95L诱导FynC-GFP-INP54p表达细胞凋亡。用FynC-GFP-INP54p或对照FynC--GFP转染BJAB细胞，并与表达人类mCD95L（DA4）不可清除突变的DT40细胞以1:5（BJAB:DT40）的比例孵育指定时间。GFP的凋亡+细胞通过Annexin V染色进行评估。显示的数据是两个独立实验的代表。(E类)抑制FynC-GFP-INP54p表达细胞中mCD95L介导的CD95下调。如D所述转染BJAB细胞，与表达mCD95L（DA4）的DT40细胞孵育30或60分钟。GFP上表面CD95表达+流式细胞术检测细胞。所示数据代表了两个独立的实验。
图3
图3
氯氰菊酯介导的内吞作用是CD95下调和细胞凋亡所必需的。(A类)CHC的分解，AP-2μ2和AP-2α使用BJAB细胞中的siRNAs。通过对指示蛋白的印迹来监测敲除效率。肌动蛋白的印迹被用作蛋白质负荷的控制（底部）。(B类)如（A）所述，将转染有指示siRNA的BJAB细胞与Flag-CD95L孵育30分钟，并通过流式细胞术评估表面CD95的表达。红色直方图显示细胞受到30分钟的刺激，而灰色阴影区域显示CD95的基础水平，而没有CD95L刺激。所示数据代表了三个实验。(C类)如（A）和（B）所述，将BJAB细胞在有（灰色）或无（白色）Flag-CD95L的情况下培养16 h，并用Annexin V和7-AAD染色定量凋亡细胞。所示数据代表了三个实验。(D类)CD95L诱导的FADD与CD95的关联被AP-2和CHC siRNA抑制。细胞转染对照组（1区和2区）、AP-2（3区）或CHC（4区）siRNA，用Flag-CD95L激活30分钟，用免疫沉淀CD95L–CD95复合物评估FADD与活化CD95的相关性。第5-7车道显示所有细胞中FADD和CD95的可比水平。(E类)CHC siRNAs抑制FADD和caspase-8与CD95的关联。BJAB细胞转染对照（1-4通道）和CHC（5-8通道）siRNA，并用Flag-CD95L激活指定时间。通过免疫沉淀法检测CD95L，免疫印迹法检测FADD、caspase-8和CD95，评估FADD和caspase-8与活化CD95的相关性。(F类)氯菊酯介导的内吞作用是CD95介导的PBT细胞凋亡所必需的。活化的人CD4+用AP-2（α+μ2)和GFP cDNA以监测表达效率。分类GFP你好在Flag-CD95L激活后（分别为30分钟和6小时），对细胞进行CD95下调（左）和凋亡（右）分析。红色直方图表示CD95L刺激的细胞，而灰色阴影区域表示未处理的细胞。%右侧对凋亡细胞进行了定量。所示数据代表了两个实验。
图4
图4
CD95 DISC复合体的内化和内体成熟。SKW6.4细胞内CD95受体转运的时间进程(A类)和Jurkat(B类)单元格。分析抗APO-1mAb处理0、3、10、30和60分钟后衍生的总细胞裂解物或磁性组分的内体成熟标志蛋白（Rab4和EEA-1）、溶酶体（CatD）、肌动蛋白、CD95和DISC蛋白。注：在Jurkat细胞中装载两倍数量的裂解蛋白以可视化Rab4、EEA-1和CatD。ACHN细胞内CD95受体转运的时间进程(C类)和HCT15(D类)单元格。如A和B所述，分析抗APO-1单克隆抗体处理后获得的总细胞裂解物或磁性部分。
图5
图5
CD95L刺激后早期内体CD95、FADD和活化caspase-8的结肠化。(A类)BJAB细胞用Cy5标记的转铁蛋白（蓝色）预孵育15分钟，不刺激或用Flag-CD95L刺激2或15分钟，然后固定并染色CD95（红色）或FADD（绿色）。反褶积分析中显示了单个和叠加荧光。所显示的数据代表了分析的200多个细胞。(B类)活化的caspase-8与内化的CD95共定位。用Flag-CD95L刺激BJAB细胞。固定细胞并对其进行CD95（左）、裂解（活性）caspase-8（中）或IgM染色。右侧显示了CD95（红色）、活性caspase-8（绿色）和IgM（蓝色）作为PM标记的合并图像（面板3、6和9）。所示数据代表分析的100多个细胞。(C类)活化caspase-8与EEA-1共定位+内体。用Flag-CD95L处理BJAB细胞15分钟后，固定并染色EEA-1（左）、活化caspase-8（中）或IgM。右侧显示了EEA-1（红色）、激活caspase-8（绿色）和IgM（蓝色）的合并图像（3和6）。(D类)用标记的CD95L刺激BJAB细胞。从总细胞膜提取物（通道1）中分离出PM（通道2-4）和内膜（通道5-7）组分。分馏后，通过FADD和caspase-8的免疫印迹分析FADD与caspase-8与活化的CD95–CD95L复合物的关联。血浆和膜内部分也进行免疫印迹，以检测IgM作为PM和EEA-1作为内体标记物。
图6
图6
CD95的内化突变体（Y291F）在CD95L介导的凋亡中受到损害。(A类)用wt人（h）CD95或hCD95（Y291F）转染A20细胞。在0分钟（灰色阴影区）、15分钟（绿色）和30分钟（红色）激活抗hCD95（CH11）后，分析细胞CD95下调情况(B类)用wt-hCD95或hCD95（Y291F）转染A20细胞。在抗hCD95（CH11）激活16 h后，使用AnnexinV/7-AAD分析细胞凋亡。所示数据是三个实验的代表性数据。(C类)用wt-hCD95或hCD95（Y291F）转染A20细胞。%在与抗hCD95（CH11）单克隆抗体孵育5和16小时后，对凋亡细胞进行定量(D类)CD95（Y291F）可以绑定FADD体外. The体外wt CD95（通道1）、内化突变CD95（Y291F）（通道2）或相应hCD95突变（V254N）的翻译ICD液化石油气cg公司将融合到FLAG表位的小鼠（第3通道）与生物素化的FADD DD孵育。使用抗FLAG单克隆抗体偶联珠免疫沉淀FLAG-CD95-bound FADD，并通过杂交分析FADD和FLAG。使用标记的GFP作为对照蛋白（通道4）。
图7
图7
CD95L介导的内化依赖性信号。(A类)转染AP-2（α+μ2)或CHC siRNAs。转染对照AP-2（α+μ2)或CHC siRNA，与Flag-CD95L或抗IgM Fab孵育指定时间2'持续5分钟。分析细胞裂解液中磷酸化Erk1/2（顶部）或总Erk1/2（底部）的表达。所示数据代表了两个实验。(B类)FynC-GFP-INP54p中NF-κB转录的激活+细胞。分析转染FynC-GFP-INP54p的BJAB细胞在Flag-CD95L、PMA或BCR刺激后NF-κB的转录激活。这些数据代表了两个实验。(C类)CD95（Y291F）激活Erk信号通路。转染wt CD95或CD95（Y291F）的A20细胞与抗hCD95单克隆抗体（CH11）孵育指定时间。分析细胞裂解物的磷酸-Erk1/2（顶部）或总Erk1/2（底部）表达。用PMA处理细胞作为阳性对照。
图8
图8
通过不诱导CD95内化或凋亡的抗APO-1 IgG2b激活非凋亡信号。(A类)刺激1小时后，通过荧光显微镜分析FITC缀合的IgG3（左两幅图）和IgG2b（右两幅图）抗APO-1单克隆抗体对SKW6.4细胞中CD95聚集的影响。(B类)用IgG3或IgG2b抗APO-1单克隆抗体在37°C下处理SKW6.4细胞1小时。在抗体处理1小时后，定量内吞CD95的细胞数量。实验分三次进行，显示为μ±标准差(C类)用IgG3（1、2、5、6、9和10道）或IgG2b（3、4、7、8、11和12道）抗APO-1单克隆抗体处理SKW6.4、H9或MCF7（FV）细胞。活化的CD95分子被免疫沉淀，并通过免疫印迹分析CD95（C20）、caspase-8和FADD。(D类)MCF7（FV）细胞的EMSA分析32携带NF-κB结合位点的P标记寡核苷酸，用1μg/ml IgG2b抗APO-1刺激指定时间。p50/p65表示NF-κB异二聚体的迁移。(E类)用1μg/ml IgG2b抗APO-1刺激MCF7（FV）细胞指定时间后，通过Western blotting分析pErk和总Erk。(F类)MCF7（FB）细胞经对照（ctr）、LzCD95L或IgG2b抗APO-1单克隆抗体处理后，用体外运动性（左）或侵袭性（右）分析。
图9
图9
早期CD95信号模型。一、 配体依赖性受体预结合。二、 微集料的形成被检测为SDS稳定集料和低水平DISC形成。结果表明，表达鞘磷脂合成酶1的细胞形成SDS稳定聚集体的效率高于SMS阴性细胞（Miyaji等，2005），表明神经酰胺虽然对CD95信号传导不是必需的，但是CD95介导的凋亡的一般增强剂。三、 将CD95招募到脂筏中形成SPOTS。四、 受体聚集也称为大脂筏平台的加盖和形成。这一步骤取决于DISC产生活性caspase-8，可以通过使用zVAD-fmk或zIETD-fmk预培养细胞来有效防止。在缺乏内化的情况下，步骤2-4的信号有可能激活非凋亡途径，但不足以杀死I型细胞。五、 激活受体的内化。六、 内化CD95迁移到内胚体室并进一步招募DISC成分。这一步骤依赖于肌动蛋白丝，因为它可以被latrunculin A（LtnA）抑制。此步骤还需要PIP2它是由氯氰菊酯介导的，因为它被INP54p的过度表达或CHC或AP-2的下调所抑制。在mCD95L诱导细胞凋亡的情况下，我们假设配体诱导的活化CD95复合物内化不再包含配体。DISC成分是FADD/Mort1、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-10和c-FLIP（未显示）。蓝色区域，DED；红区，DD；CD95中的N端PLAD以不同的绿色显示。
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