The nucleocapsid protein of severe acute respiratory syndrome-coronavirus inhibits the activity of cyclin-cyclin-dependent kinase complex and blocks S phase progression in mammalian cells

doi:10.1074/jbc.M509233200

.2006年4月21日；281(16):10669-81.

doi:10.1074/jbc。M509233200。 Epub 2006年1月23日。

严重急性呼吸综合征冠状病毒核衣壳蛋白抑制细胞周期素依赖性激酶复合体的活性并阻断哺乳动物细胞S期进展

米兰苏尔吉特¹, 刘伯平, 文森特·T·K·周, 苏尼尔·卡拉尔

附属公司

PMID： 16431923
预防性维修识别码： PMC7995956
内政部： 10.1074/jbc。M509233200型

严重急性呼吸综合征冠状病毒核衣壳蛋白抑制细胞周期素依赖性激酶复合体的活性并阻断哺乳动物细胞S期进展

米兰苏尔吉特等。生物化学杂志. 2006.

.2006年4月21日；281(16):10669-81.

doi:10.1074/jbc。M509233200。 Epub 2006年1月23日。

作者

米兰苏尔吉特¹, 刘伯平, 文森特·T·K·周, 苏尼尔·卡拉尔

附属

¹印度新德里Aruna Asaf Ali路国际基因工程和生物技术中心病毒学小组，邮编：110067。

PMID： 16431923
预防性维修识别码： PMC7995956
内政部： 10.1074/jbc。M509233200型

摘要

细胞周期的放松调控是许多DNA和RNA病毒为了自身利益而诱捕和利用宿主细胞机制的一种常见策略。在许多冠状病毒中，核衣壳蛋白（N蛋白）被证明可以抑制细胞周期进程，尽管其背后的机制尚不清楚。严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）的N蛋白具有与细胞周期蛋白结合和通过细胞周期依赖性激酶（CDK）磷酸化的特征性基序，最近我们报道了其被细胞周期蛋白-CDK复合物磷酸化（Surjit，M.，Kumar，R.，Mishra，R.N.，Reddy，M.K.，Chow，V.T.和Lal，S.K.（2005）J。维罗尔。79, 11476-11486). 在本研究中，我们证明SARS-CoV的N蛋白可以抑制哺乳动物细胞系的S期进展。发现N蛋白表达直接抑制细胞周期蛋白-CDK复合体的活性，导致视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化降低，同时E2F1介导的反式激活也随之下调。在这种条件下共表达E2F1可以恢复S期基因的表达。通过对RXL和CDK磷酸化突变N蛋白的分析，确定了抑制CDK4和CDK2活性的机制不同。而N蛋白可以直接与细胞周期蛋白D结合，抑制CDK4-cyclin D复合物的活性；CDK2活性的抑制似乎通过两种不同的方式实现：间接下调CDK2、细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白A的蛋白水平，以及通过N蛋白与CDK2-细胞周期蛋白复合物的直接结合。在SARS-CoV感染的VeroE6细胞中也观察到E2F1靶点下调。这些数据表明，N蛋白的S期抑制活性在病毒发病过程中可能具有重要意义。

PubMed免责声明

数字

图1
**N蛋白表达下调cyclin-CDK活性。**一个，转染pCDN3.1的Huh7细胞(*M（M）*)或pCDNA3.1N(N个)质粒饥饿34h，然后用10%牛血清刺激指定的时间段。用CDK4免疫沉淀溶解液的等分样品(*第一个面板*)，细胞周期蛋白D(*第二个面板*)和CDK6(*第四个面板*)抗体，用于*在体外*磷酸化测定(*体外受精*).PS（聚苯乙烯），刺激后。对总细胞裂解物的一部分进行免疫印迹(*世界银行*)带CDK4(*第三个面板*)，CDK6(*第五个面板*)，或抗Myc(*第六面板*)抗体。这个图表表示三个独立实验的平均±S.D.相对带强度。在图表，每个设置属于酒吧表示相应的车道在凝胶中*在上面*.数字1-6分别代表模拟和pCDNA3.1N转染样品在3、6和9小时的时间点。*深灰色*，*浅灰色*、和*黑色条*分别表示CDK4、细胞周期蛋白D和CDK6的带强度。这个*第七面板*表示刺激期后3、6和9小时的细胞周期状态的FACS分析。数字表示特定阶段的细胞百分比。B类，细胞按照一个用细胞周期蛋白D抗体免疫沉淀，用CDK4免疫印迹小份裂解液(*第二个面板*)或第27页(*第三个面板*)抗体。p27印迹被剥离并用细胞周期蛋白D抗体重新处理(*第一个面板*). 用总ERK抗体对总细胞裂解物的一部分进行免疫印迹，以检查等负荷(*第四个面板*).C类，在指定的时间段采集如上所述保持的细胞，以及*在体外*使用CDK2进行磷酸化(*第一个面板*)，细胞周期蛋白E(*第二个面板*)和细胞周期蛋白A(*第三个面板*)抗体。用CDK4对总细胞裂解液的等分样品进行免疫印迹(*第四个面板*)或抗Myc(*第六面板*)抗体。在图表，*深灰色*，*浅灰色*、和*黑色条*分别代表CDK2、细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白A的活性。*数字1-6*分别表示9、12和15小时时的模拟和pCDNA3.1N转染样品。这个*底部面板*表示刺激期后9、12和15小时的细胞周期状态的FACS分析。数字表示特定阶段的细胞百分比。D类，细胞按照C类用CDK2抗体免疫沉淀，用细胞周期蛋白E免疫印迹小份裂解液(*第一个面板*)和细胞周期蛋白A(*第二个面板*)抗体。剥离细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E印迹，并用CDK2重新标记(*第三个面板*)和总p38(*第四个面板*)抗体。在图表，的*深灰色*，*浅灰色*、和*黑色条*分别代表细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A和CDK2蛋白水平。*数字1-6*分别表示9、12和15小时时的模拟和pCDNA3.1N转染样品。E类，Huh7细胞转染指定数量的相应质粒并收获4 h(*车道1–3*)或12小时(*车道4-6）*10%牛血清刺激后。安*在体外*使用CDK4从等量的裂解液中进行磷酸化分析(*车道1–3*)或CDK2(*车道4–6*)抗体。F类，CDK4在体外磷酸化如所述一个使用Rb作为基底(*第一个面板*). 用CDK4抗体对总细胞裂解液的等分样品进行免疫印迹。

图2
**N蛋白的表达导致Rb的低磷酸化和E2F1靶点的下调。**一个，转染pCDN3.1的Huh7细胞(*M（M）*)或pCDNA3.1N(N个)质粒饥饿34h，然后用10%的牛血清模拟指定的时间段。用磷酸化Rb（Ser⁷⁹⁵)(*上部面板*)或总Akt抗体(*下部面板*). 使用NIH Image程序量化P-Rb带强度，并参考总Akt的强度进行归一化，绘制图表。*PS（聚苯乙烯）*，刺激后。B类，单元格保持为一个在指定的时间段内，用于制备核提取物。用E2F1抗体免疫沉淀每个样品中等量的核裂解物，并用Rb免疫印迹(*第一个面板*)和HDAC1(*第三个面板*)抗体。Rb印迹被剥离并用E2F1抗体进行免疫印迹(*第二个面板*). 用磷酸化p38抗体对总核裂解物的等分样品进行免疫印迹(*第四个面板*).C类，在SDS裂解缓冲液中收集保持在A中指定时间段的细胞，并用细胞周期蛋白E对裂解产物的等分部分进行免疫印迹(*第一个面板*)，CDK2(*第二个面板*)和CDK4(*第三个面板*)抗体。剥离CDK4印迹并用总p38抗体进行免疫印迹(*第四个面板*).D类，细胞转染野生型(*1–4车道*)或E2F元件突变体(*车道5*和6)cyclin E CAT报告子和pCDNA3.1N(*车道2*，三，4、和6)和pSGI E2F1(*车道5*和6)在刺激后15小时在磷酸盐缓冲盐水中采集，并进行CAT报告试验。使用pCDNA3.1 DNA，每个样本的转染DNA总量保持不变。样品通过薄层色谱进行解析，并对斑点强度进行量化和绘图。这个图表表示三个实验的平均值±S.D。E类，转染pCDNA3.1的细胞(*车道1*)或pCDNA3.1N(*车道2*)或pCDNA3.1N以及指定数量的pSGI E2F1质粒(*车道3*和4)饥饿34h，用10%牛血清刺激12h后收获。用CDK2抗体免疫沉淀裂解液的等分样品，并处理以用于*在体外*磷酸化测定(*体外受精*;*上部面板*). 用CDK2对部分裂解物进行免疫印迹(*第二个面板*)或总p38(*第三个面板*)抗体。使用pCDNA3.1 DNA使每个样本的转染DNA总量相等。在图表，*深灰色*和*浅灰色条*分别代表CDK2活性和CDK2蛋白水平。

图3
**CDK2活性的下调独立于p16、p27和p21。**一个，转染pCDN3.1的Huh7细胞(*M（M）*)或pCDNA3.1N(N个)质粒饥饿34h，然后用10%的牛血清模拟指定的时间段。用总p16抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹(*第一个面板*).PS（聚苯乙烯），刺激后。剥离相同的印迹，并用ERK总抗体进行重复(*第二个面板*).B类，转染pCDNA3.1的Huh7细胞(*M（M）*)或pCDNA3.1N(N个)质粒饥饿34h，然后用10%的牛血清模拟指定的时间段。用总p27对总细胞裂解物进行免疫印迹(*第一个面板*)，总p21(*第二个面板*)和磷酸-p27（Thr¹⁸⁷) (*第三个面板*)抗体。剥离P-p27印迹并用总ERK重制(*第四个面板*)抗体。带强度根据总ERK和图形绘制的带强度进行标准化。这个形象是三个实验的代表。在图表，每个设置属于酒吧表示相应的车道在凝胶中*在上面*;*深灰色*，*浅灰色*、和*黑色条*分别表示p27、p21和P-p27带强度。

图4
**外源性N蛋白可抑制CDK活性。**一个，*在体外*磷酸化(*体外循环*)使用CDK4进行分析(*车道1*和2)或CDK2(*车道3*和4)和反式添加表达N蛋白的样品(*车道3*和4). 在图表.PS（聚苯乙烯），刺激后。B类，pCDNA3.1(*M（M）*，*车道1*)或pCDNA3.1N(N个，*车道2*)转染后48小时收集转染细胞，用抗Myc抗体免疫印迹小份裂解液。C类，将接种在50%汇流处的COS7细胞饥饿34小时，然后用10%牛血清刺激4小时(*车道1–3*)或12小时(*车道4–6*)，并在免疫沉淀缓冲液中制备总细胞裂解物。将裂解液平均分为三管，并与10μl模拟TNT裂解液混合(*车道2*和5和*车道3*和6）。体外使用指示的抗体进行磷酸化。D类，单元格保持为C类在刺激后12 h收获，并将免疫沉淀缓冲液中制备的总细胞裂解液与指示量的纯化Rb蛋白混合。体外使用CDK2抗体进行磷酸化。

图5
**N蛋白突变体显示出不同的抑制CDK4和CDK2活性的机制。**一个，N蛋白的RXL和RGNSPAR基序以及相应的突变氨基酸残基的示意图(美国).B类通过标记判断野生型和突变型N蛋白的表达[³⁵S] 半胱氨酸/蛋氨酸前体与免疫沉淀(*IP（IP）*)带有抗Myc（9E10）抗体。将每个4μg DNA转染到Huh7细胞中；转染后48小时，收集细胞并进行免疫沉淀，用12%SDS-PAGE对样品进行解析，并用荧光法检测条带。*M（M）*，pCDNA3.1-转染样品；N个野生型核衣壳；C类，右*X（X）*L突变体核衣壳；KCDK基序突变核衣壳；*CK公司*，右*X（X）*L和CDK基序双突变核衣壳。C类，*在体外*磷酸化(*体外受精*)组蛋白H1在CDK4表达的突变N蛋白细胞裂解物中的表达(*第一个面板*)或CDK2(*第三个面板*). 免疫印迹法检测溶出液的等分样品(*世界银行*)CDK4和总p38(第二和*第四个面板*）抗体。这个图表表示三个独立实验的±S.E。在图表，*深灰色*和*浅灰色条*分别代表CDK4和CDK2活性。D类将分别表达细胞周期蛋白D的TNT裂解液和不同的N蛋白各10μl混合在免疫沉淀缓冲液中。样品用cyclin D抗体免疫沉淀，用抗Myc（9E10）抗体免疫印迹(*第一个面板*). 同样的印迹被剥离，并用细胞周期蛋白D抗体进行复制(*第二个面板*).E类，N蛋白与内源性细胞周期蛋白D-CDK4复合物的结合。表达不同N蛋白突变体的细胞在刺激后4 h用cyclin D抗体免疫沉淀，样品的等分部分用抗Myc（9E10）免疫印迹(*第一个面板*)和CDK4(*第三个面板*)抗体。剥离核衣壳蛋白印迹，并用细胞周期蛋白D复制(*第二个面板*)抗体。F类，N蛋白与内源性细胞周期蛋白A-CD2复合物的结合。将转染有所示质粒的细胞饥饿34小时，然后用10%FBS刺激12小时，并用[³⁵S] 半胱氨酸/蛋氨酸promix 2 h。用抗Myc（9E10）抗体免疫沉淀等量样品，并用cyclin A抗体免疫印迹(*第一个面板*). 同样的印迹被剥离并用CDK2抗体重新标记(*第二个面板*). CDK2印迹气干并暴露于x射线胶片(*第三个面板*). 用总p38抗体对总细胞裂解液的等分样品进行免疫印迹(*第四个面板*).

图6
**外源添加的突变N蛋白可以抑制CDK2的活性。**一个，的表达式分析[³⁵S] 半胱氨酸/蛋氨酸前体标记模拟翻译TNT裂解物(*车道1*)或表达不同N蛋白突变体的裂解物(*车道2–5*). 每个样品的5μl在12%SDS-PAGE上溶解，并通过放射自显影术检测条带。B类，外源性添加RX（X）L突变体N蛋白可抑制CDK2活性。将接种在50%汇合处的细胞饥饿34小时，然后用10%牛血清刺激12小时。细胞裂解液平均分为五个管，并与5或10μl TNT表达的C和K基序突变体N蛋白（突变体C5和C10以及突变体K5和K10）或10μl模拟裂解液混合(*车道1*).体外磷酸化(*体外受精*)使用CDK2完成。C类，用相应抗体免疫沉淀表达所示蛋白的细菌裂解物，以及*在体外*以组蛋白H1为底物进行磷酸化。*M（M）*，模拟表达的裂解产物。D类将细菌裂解液重组的细胞周期蛋白A-CDK2复合物固定在与CDK2抗体结合的蛋白A-Sepharose微球上。体外磷酸化是在1μg纯化的重组Rb蛋白或与指示量的纯化组蛋白H1一起存在的情况下进行的。E类，不同突变N蛋白的存在对*在体外*重组CDK2活性(*上面板*).M（M），模拟翻译裂解物。安*在体外*磷酸化分析如E类用CDK2抗体免疫印迹裂解液的等分样品(*下部面板*).世界银行，Western blot。

图7
**下调SARS-CoV感染Vero E6细胞中E2F1靶点的表达并抑制CDK2活性。**模拟感染(*M（M）*)或SARS-CoV感染(*S公司*)Vero E6细胞经福尔马林固定和热灭活。用细胞周期蛋白E免疫印迹总细胞裂解液的等分样品(*第一个面板*)，CDK2(*第二个面板*)，第27页(*第三个面板*)，抗核衣壳(N个)(*第四个面板*)和calnexin(*第五个面板*)抗体。数据是两个独立实验的代表。

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