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。2006年1月；130(1):104-19.
doi:10.1053/j.gastro.2005.10.012。

Bid的持续磷酸化是慢性肝病患者抵抗Fas诱导凋亡的标志

阿恩特·沃格尔 1, 约瑟夫·阿斯兰, 霍尔格·威伦格林, 克里斯蒂安·克里恩, 米尔顿·费内戈尔德, 霍华德·蒙特, 加里·托马斯, 马库斯·格朗普
附属公司

Bid的持续磷酸化是慢性肝病患者抵抗Fas诱导凋亡的标志

阿恩特·沃格尔等。 胃肠病学。 2006年1月。

摘要

背景和目标：据报道，细胞凋亡率的增加在包括肝脏疾病在内的许多疾病的病理生理学中发挥作用。相反，导致程序性细胞死亡受损的基因突变与癌症的发展有关。然而，凋亡抵抗也可能是非遗传应激适应的结果，如致癌代谢性肝病遗传性酪氨酸血症。为了阐明应激诱导的细胞凋亡抵抗是否是慢性肝病的一般特征，对慢性胆汁淤积动物模型进行了检查。

方法：在胆管结扎前和结扎后2周对小鼠进行研究，在NTBC停药前后对Fah-/-和Fah/p21-/-小鼠进行研究。

结果：在这里，我们发现胆管结扎诱导了对Fas单克隆抗体介导的肝细胞死亡的深刻抵抗。凋亡信号通路在caspase-8激活下游和线粒体细胞色素c释放近端被阻断。在对照组中，Fas受体的激活导致Bid的快速去磷酸化及其随后的分裂，而在慢性胆汁淤积和其他肝细胞凋亡抵抗模型中，Bid仍保持磷酸化和去磷酸化。

结论：我们提出了一个模型，其中Bid的磷酸化状态决定了体内肝细胞的凋亡阈值。此外，慢性胆汁淤积症患者对细胞凋亡的抵抗可能有助于这种情况下癌症的长期风险。

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数字

图1
图1
胆管结扎小鼠对Fas诱导的凋亡产生抵抗。(A类)野生型小鼠接受BDL，并接受Fas mAb Jo的挑战214天后（0.35μg/g）。控制权的存续(正方形)和胆管结扎(三角形)展示的是老鼠。所有对照小鼠（n=10）在注射Jo后12小时内死于急性肝衰竭2而所有胆管结扎小鼠均存活（n=10）。(B类)Jo挑战后的DNA阶梯2仅在对照组小鼠中可见。显示了每种条件下复制动物的结果。标准DNA阶梯标记(米)如图所示。(C类)TUNEL染色(棕色)Jo前后对照组和胆管结扎组小鼠的肝脏切片显示（原始放大200倍）2注入。TUNEL阳性细胞仅在Jo治疗后的对照小鼠中可见2注入。
图2
图2
胆道结扎小鼠的线粒体通路被阻断。(A类)Jo术后肝损伤2控制挑战（WT）；开放式列)（n=4）和胆管结扎小鼠(填充的列)（n＝4）。用Jo激发前（F.0）和激发后（F.4）测定血浆中丙氨酸转氨酶和胆红素水平2.丙氨酸转氨酶水平仅在Jo治疗后的对照小鼠中升高2注入。胆道结扎小鼠的胆红素水平显著升高。Jo后2小时（F.2；Caspase 8）或4小时（F.4；caspase3）肝匀浆中的Caspase-8和Caspase-3活性测定2注入（n=4个）。在这两个组中，均观察到caspase-8的激活，而caspase-3的活性仅在对照小鼠中检测到。(B类)Bid、Bax、细胞色素的蛋白质印迹c（c）和半胱氨酸蛋白酶-9在Jo诱导细胞凋亡前（基础）和4小时后（Fas）2在对照组和胆管结扎小鼠中（每组4只；此处显示的4个样本中的2个），以确定线粒体凋亡途径的激活。Bid裂解（全长Bid减少），Bax移位，细胞色素释放c（c），以及Jo后胱天蛋白酶-9的裂解2仅在对照组小鼠中发生。F.0，注射Fas mAb前，F.2/F.4，注射Fas-mAb后2/4小时。
图3
图3
野生型和胆管结扎小鼠线粒体途径分析。(A类)在未注射Fas单克隆抗体的基础状态下，对对照组和胆管结扎组小鼠的肝组织进行Western blot分析。所示为每组4只小鼠中的2只的数据。分析肝组织中Fas-R、Flip的总细胞水平秒/升、cIap-2、Bax、Bid、Bak、Bcl-2、Bcl-x和A1/Bfl-1。在所有分析的蛋白质中，只有A1/Bfl-1在BDL后2周被显著诱导。(B类)对照组和胆管结扎小鼠的肝脏提取物与体外激活的重组caspase-8孵育。两组caspase-3和caspase-9体外裂解的Western blot显示无差异。(C类)对对照组和胆管结扎组小鼠的线粒体部分进行BH-3样蛋白分析。Bak、Bcl-2和Bcl-x水平在Jo激发前后没有显著变化2然而，BDL后2周，甚至在Jo之前，这一部分的投标价格显著增加2注入。(D类)胆管结扎小鼠和对照组线粒体的碱性提取。与Bcl-x相比，Bid和Bax仅松散附着，未插入胆管结扎小鼠的线粒体膜(E类)将分离的肝线粒体（每个4个；此处显示的4个样品中的2个）与不同浓度的体外裂解tBid和细胞色素移位孵育c（c）用细胞色素免疫印迹法监测从线粒体（mito）部分到胞浆（释放）的变化c（c）抗体。细胞色素c（c）显示了用5 nmol/L tBid培养后的释放。第一行（−），自发细胞色素c（c）释放而不进行tBid孵化；第二排至第九排，线粒体细胞色素总量c（c）显示相应样品的含量（每组n=2），然后是释放的胞质细胞色素c（c）用tBid孵育后的分数。细胞色素无差异c（c）胆管结扎小鼠和对照组之间的释放。
图4
图4
在胆管结扎和胆管内注射Fas后，Bid未去磷酸化法赫−/−/第21页−/−老鼠。(A类)通过Western blot检测对照组和胆管结扎小鼠肝细胞溶质提取物中S61处Bid的磷酸化。胆道结扎小鼠胆汁中Bid磷酸化增加（n=4只；此处显示的4个样品中的2个），然后用Jo激发2更重要的是，Jo之后没有去磷酸化2看到了注射。相反，在诱导对照小鼠凋亡后，Bid几乎完全去磷酸化。(B类)Western blot分析对照组和胆管结扎小鼠细胞提取物中CK1ε和PP2A水平。胆道结扎小鼠的细胞溶质CK1ε水平较高。细胞溶质提取物中PP2A的水平没有变化（数据未显示）。(C类)用CK1特异性肽（n=4）在对照组和胆管结扎小鼠的细胞提取物中测定CK1活性。请注意，活性分析不是针对CK1ε的，而是测量CK1总活性。胆道结扎小鼠的CK1活性在所有时间点都较高。有趣的是，对照组小鼠服用Jo后CK1活性降低2但在胆管结扎的小鼠中没有观察到这种减少。(D类)Jo后对照组和胆管结扎小鼠的细胞提取物2分析注射用His6-Bid的体外磷酸化活性（代表性印迹，n=4个）；阴性对照（−）不含细胞提取物，阳性对照（CK1）含有重组CK1。所示为用磷特异性Bid（S61）抗体探测的膜的蛋白质印迹。Bid的磷酸化仅在胆管结扎小鼠中检测到，而在对照组中几乎没有。CK1抑制剂（CKI-7）显著抑制胆管结扎小鼠的His6-Bid磷酸化。显示了非CKI-7处理反应的总His6-Bid水平。(E类)法赫−/−和法赫−/−/第21页−/−老鼠被Jo攻击2NTBC退出后2周。Bid和细胞色素的去磷酸化和随后的裂解c（c）释放仅发生在双基因敲除小鼠中。CK1ε总水平没有变化，而细胞溶质水平在法赫−/−/第21页−/−老鼠跟着乔2注入。(F类)野生型小鼠注射Jo2单独或与苏拉明一起。苏拉明可防止Bid的去磷酸化以及随后的Bid裂解和细胞色素c（c）释放。苏拉明治疗小鼠的细胞膜CK1ε水平较高。(G公司)在苏拉明治疗的小鼠中，Jo治疗后仅能看到少量分散的TUNEL阳性肝细胞2注入。
图5
图5
Atm在体外磷酸化Bid，但在慢性肝病期间，它对防止Fas诱导的细胞凋亡是不必要的。(A类)胆道结扎小鼠的ATM-p53 DNA损伤途径被激活，通过p53磷酸化增加以及p53和效应蛋白p21和Bax的整体水平增加进行测量。(B类)重组Atm体外磷酸化Bid-GST。(C类)胆管-结扎Atm−/−与野生型小鼠相似，Fas单克隆抗体诱导的细胞凋亡对小鼠有保护作用。Bid的去磷酸化和随后的Bid裂解，细胞色素的释放c（c）caspase-9和caspase-3仅在野生型小鼠中发生裂解。(D类和E类)TUNEL染色(棕色)肝脏切片显示（原始放大200倍）。TUNEL阳性细胞仅可见(D类)Jo后6小时在对照组小鼠中2注入但不注入(E类)在大气中−/−老鼠。(F类)胆道结扎小鼠的细胞膜CK1ε水平再次升高，而PP2A水平保持不变。
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