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。2006年3月；17(3):1261-72.
doi:10.1091/mbc.e05-10-0927。 Epub 2005年12月21日。

Src家族激酶参与黑色素瘤细胞经内皮细胞迁移过程中N-钙粘蛋白磷酸化和β-连环蛋白解离

齐剑飞 1, 王俊福, 奥列娜·罗曼纽克, Chi-Hung Siu先生
附属公司

Src家族激酶参与黑色素瘤细胞跨内皮迁移过程中N-钙粘蛋白磷酸化和β-连环蛋白解离

齐剑飞等。 分子生物学细胞。 2006年3月。

摘要

在与接种在单层内皮细胞顶部的肿瘤细胞共培养系统中，在黑色素瘤细胞跨内皮细胞迁移期间，N-钙粘蛋白被招募到异型接触中。然而，β-catenin从N-钙粘蛋白中分离出来，并重新分布到迁移的黑色素瘤细胞的细胞核中，以激活基因转录。在本报告中，我们证明了Src在迁移的黑色素瘤细胞和邻近内皮细胞之间的异型接触中被激活。Src激活与N-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化在时间上密切相关。黑色素瘤细胞中显性负性Src的表达阻断了N-钙粘素磷酸化、β-catenin解离和迁移细胞中的核移位，这与Src家族激酶的参与相一致。在体外结合分析中，Src介导的N-钙粘蛋白胞质结构域磷酸化导致β-连环蛋白结合显著降低。虽然通过质谱法可以在N-钙粘蛋白细胞质域上鉴定出五个磷酸酪氨酸残基，但定点突变表明Tyr-860是参与β-连环蛋白结合的关键氨基酸。携带Y860F突变的N-钙粘蛋白的过度表达抑制了转染细胞在内皮细胞上的迁移。总之，这些数据表明，在黑色素瘤细胞经内皮细胞迁移过程中，Src家族激酶对N-钙粘蛋白酪氨酸磷酸化在调节β-连环蛋白关联中的新作用。

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图1。
图1。
Src-特异性抑制剂PP2对N-钙粘蛋白酪氨酸磷酸化和黑色素瘤细胞TEM的影响。标记的黑色素瘤细胞（红色）在内皮细胞单层上培养，存在不同的激酶抑制剂。只有PP2抑制N-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化和β-连环蛋白的分离。AG1478的数据显示为其他非抑制性化合物的代表。（A） 在共培养5小时时固定TEM分析盖玻片，并对磷酸酪氨酸、β-连环蛋白或N-钙粘蛋白（绿色）进行免疫染色。箭头表示黑色素瘤细胞和内皮细胞之间的异型接触，开放箭头表示内皮连接处的β-连环蛋白标记。箭头表示核β-连环蛋白在迁移的黑色素瘤细胞中积聚。棒材，10μm。（B） 在AG1478或PP2存在的情况下进行共培养。在0和5小时收集样本，用N-钙粘蛋白抗体进行免疫沉淀。通过对N-钙粘蛋白、β-连环蛋白或磷酸酪氨酸的免疫印迹分析免疫沉淀物，PP2抑制β-catenin解离。（C） 在AG1478或PP2存在的情况下进行TEM分析。在5 h时对迁移细胞的百分比进行评分。数据表示平均值±SD（n=3）。
图2。
图2。
黑色素瘤细胞TEM中异型接触处的Src激活。（A） 在WM239黑色素瘤细胞中表达GFP标记WT和DN Src的稳定转染体的免疫印迹。内源性Src用箭头表示，GFP标记的Src由箭头表示。（B） 共聚焦图像显示WT-Src-GFP在黑色素瘤细胞转染物中的定位。（C） 共聚焦图像显示了细胞附着和迁移期间异型接触处WT-Src-GFP的浓度。箭头表示转染的黑色素瘤细胞和内皮细胞之间的异型接触。（D） 非转染黑色素瘤细胞透射电镜下异型接触激活Src（p-Src）的免疫定位。（a和b）固定于1小时的共培养物显示黑色素瘤细胞处于附着阶段。（c和d）固定在5小时的共培养，显示了迁移阶段。对对照共培养物（a和c）和固定前用1 mM渗透酸盐预处理5分钟的共培养物进行p-Src免疫染色。黑色素瘤细胞标有星号。箭头表示黑色素瘤细胞和内皮细胞之间的异型接触，箭头表示同型内皮细胞连接。棒材，10μm（B、C和D）。（E） 免疫印迹显示PP2在TEM期间消除了Src激活。在有或无PP2的情况下，将黑色素瘤细胞培养在内皮单层上。在0或5小时收集细胞，并针对p-Src和Src进行免疫印迹检测。（F） 免疫印迹显示WT-Src和DN-Src转染剂中的p-Src水平。（G） 将Src转染物培养在内皮单层上，在0或5小时收集细胞进行p-Src免疫印迹分析。在F和G中，箭头表示WT-或DN-Src-GFP，而箭头表示内源性Src。
图3。
图3。
DN-Src表达对黑色素瘤细胞Src激活、β-catenin信号和TEM的影响。（A） 共聚焦图像显示Src-GFP转染物TEM期间β-catenin和p-Src的免疫定位（星号）。在对p-Src进行免疫染色之前，用过碘酸钾处理细胞5分钟。箭头表示Src-GFP转染物与内皮细胞之间的异型接触，箭头表示β-catenin的核标记和核周标记。棒材，10μm。（B） 通过PP2或DN-Src转染抑制转移性黑色素瘤细胞中β-catenin介导的基因转录。用TOPflash载体瞬时转染细胞，然后在内皮单层上培养(▪) 或PP2缺失（□）。在共培养5 h时收集细胞并分析荧光素酶活性。将共培养5h时的荧光素酶活性归一化为共培养0h时的荧光素酶活性，并计算荧光素酶活的相对增加量。数据表示平均值±SD（n=3）。（C） PP2或DN-Src转染抑制黑色素瘤细胞TEM。在存在的情况下对细胞进行TEM分析(▪) 或PP2缺失（□）。在5 h时对迁移细胞的百分比进行评分。数据表示平均值±SD（n=3）。
图4。
图4。
体外N-钙粘蛋白胞质结构域的磷酸化破坏了其与β-连环蛋白的相互作用。（A） 活性Src对重组N-cadherin胞质域（N-cad-cyt）的磷酸化。将磷酸化反应进行不同的时间，并将反应的等分样品进行SDS-PAGE。用抗N-钙粘蛋白和磷酸酪氨酸抗体检测免疫印迹。（B） β-catenin与磷酸化N-钙粘蛋白胞质域（N-cad-cyt）结合的减少。GST标记的N-cad-cyt在有或无ATP的情况下由Src在体外磷酸化，然后与His-taggedβ-catenin孵育。用谷胱甘肽珠分离蛋白质复合物，并用免疫印迹检测β-连环蛋白、N-钙粘蛋白和磷酸酪氨酸。
图5。
图5。
通过Src体外磷酸化后鉴定N-钙粘蛋白细胞质域上的磷酸-酪氨酸残基。光谱成对显示了在存在或不存在ATP的情况下发生磷酸化反应的肽。磷酸化肽以新的峰值出现，质量增加80 Da。（A）通过Src在体外磷酸化His-tagged N-cadherin细胞质结构域，然后进行MALDI-TOF质谱分析。（B和C）His-tagged N-cadherin胞质结构域在体外被Src磷酸化，然后被胰蛋白酶消化。对胰蛋白酶肽进行MALDI质谱分析。（B） 肽AADNDPTAPP中磷酸化Y852、Y860、Y884和Y886残基的鉴定Y（Y）DSLLVFDYEGSGSTAGSLSSLNSSSSGGEQD公司Y（Y）D类Y（Y）LNDWGPR（5448 Da）。（C） 多肽MDERPIHAEPQ中磷酸化Y820的鉴定Y（Y）PVR（1838 Da）和RMDERPIHAEPQY（Y）PVR（1994年数据）。
图6。
图6。
N-cadherin Y860磷酸化对体外β-catenin结合的影响。（A） 在N-钙粘蛋白胞质结构域上鉴定的五个酪氨酸残基分别突变为苯丙氨酸。GST标记的突变蛋白从细菌中纯化，然后在体外通过Src磷酸化。磷酸化蛋白与His-taggedβ-catenin进行结合试验。用谷胱甘肽-脑葡萄糖珠分离蛋白质复合物，并用抗β-连环蛋白、N-钙粘蛋白和磷酸酪氨酸的抗体检测免疫印迹。携带Y860F突变的蛋白质的磷酸化不影响其与β-连环蛋白的结合（星号）。（B） 突变N-钙粘蛋白胞质结构域和β-连环蛋白之间结合分析的定量。在结合试验之前，突变的N-cadherin细胞质域在存在（黑条）或不存在（灰条）ATP的情况下进行体外Src磷酸化反应。这个年-轴显示下拉复合物中结合的β-catenin与N-cadherin细胞质结构域的比率。*，学生的t吨p>0.1检验表明，磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的β-catenin结合水平没有显著差异。数据表示平均值±SD（n=3）。（C） 不同经典钙粘蛋白核心β-连环蛋白结合区的保护。人类N-钙粘蛋白的Tyr-852和Tyr-860以及其他钙粘蛋白序列中的相应残基以粗体显示。实线表示通过x射线晶体学鉴定的小鼠E-钙粘蛋白-β-连环蛋白复合物中的核心相互作用区域（Huber和Weis，2001）。虚线表示通过肽竞争在N-钙粘蛋白中识别的核心区域（Xu等., 2002). *, VE-cadherin–β-catenin相互作用所必需的酪氨酸残基（Potter等., 2005).
图7。
图7。
突变N-cadherin表达对黑色素瘤细胞β-catenin分离和TEM的影响。（A） 用myc标记的野生型或突变型（Y860F）N-cadherin瞬时转染WM239细胞。免疫印迹分析证实myc标记蛋白的表达。箭头表示内源性N-钙粘蛋白，箭头表示myc标记的野生型N-钙粘素（通道2）或myc标记突变型N-cadherin（通道3）的表达。控制单元显示在通道1中。（B） 转染物与内皮单层共培养5小时，然后固定，并使用myc单克隆抗体和兔抗β-连环蛋白抗体进行双重染色。Myc染色用于鉴定转染细胞（星号），共聚焦图像仅显示β-catenin染色：表达Myc标记的突变型N-cadherin（a）的黑色素瘤细胞和表达Myc标签的野生型N-cadtherin（b）的黑素瘤细胞。箭头表示转染剂和内皮细胞之间的异型接触。棒材，10μm。（C） 用野生型N-cadherin-myc或突变型N-cadherin-myc瞬时转染黑色素瘤细胞，并以3:1的比例与内皮单层细胞共培养。在0或5小时收集样本，用抗myc抗体进行免疫沉淀。用抗β-连环蛋白、N-钙粘蛋白和磷酸酪氨酸的抗体探测免疫沉淀物的蛋白印迹。pTyr阳性带对应于myc标记的N-钙粘蛋白。（D）瞬时表达野生型或突变myc标记N-钙粘素的转基因细胞接受TEM分析。在共培养5小时时对myc阳性细胞的迁移进行评分。数据表示平均值±SD（n=3）。
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