Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity

doi:10.1073/pnas.0507360102

.2005年11月15日；102(46):16842-7.

doi:10.1073/pnas.0507360102。 Epub 2005年11月3日。

富含亮氨酸重复激酶2的帕金森病相关突变增强激酶活性

安德鲁·韦斯特¹, 达伦·J·摩尔, Saskia Biskup公司, 阿特姆·布加延科, 万利·W·史密斯, 克里斯托弗·罗斯, 瓦琳娜·道森, 泰德·道森

附属公司

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DOI（操作界面）： 10.1073/pnas.0507360102

富含亮氨酸重复激酶2的帕金森病相关突变增强激酶活性

安德鲁·韦斯特等。美国国家科学院程序. 2005.

.2005年11月15日；102(46):16842-7.

doi:10.1073/pnas.0507360102。 Epub 2005年11月3日。

作者

安德鲁·韦斯特¹, 达伦·J·摩尔, Saskia Biskup公司, 阿尔特姆·布加延科, 万利·W·史密斯, 克里斯托弗·罗斯, 瓦琳娜·道森, 泰德·道森

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经病学系细胞工程研究所，邮编21205。

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摘要

富含亮氨酸重复激酶2基因（LRRK2）的突变导致晚发性帕金森病（PD），其临床表现与特发性PD无明显区别。初步研究表明，LRRK3突变是PD易感性的最常见但已确定的决定因素，以常染色体显性遗传方式传播。在此，我们对人脑中的LRRK2基因和转录物进行了表征，并亚克隆了主要的ORF。外源表达的LRRK2蛋白在约280kDa处迁移，主要存在于细胞质中，但也与线粒体外膜相关。家族连锁突变G2019S或R1441C对蛋白质稳态水平、周转或定位没有明显影响。然而，使用全长重组LRRK2进行的体外激酶分析显示，由家族连锁突变引起的活性增加，这些突变包括自磷酸化和通用底物的磷酸化。这些结果表明，LRRK2相关疾病的功能获得机制与激酶活性在PD发展中的中心作用有关。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
LRRK2表达特征。(A类)使用溴化乙锭琼脂糖凝胶上解析的人类全脑cDNA进行5′-RACE巢式PCR。预测中相应反义寡核苷酸的外显子位置*LRRK2型*给出了成绩单。(B类)LRRK2基因5′端的图示。ATG代表起始区域下游第一个一致的Kozak序列的存在和主要序列的开始*LRRK2型*ORF公司。(C类)使用跨越预测LRRK2转录物3′端的寡核苷酸引物进行RT-PCR。指出了来自人类组织或细胞系的cDNA来源。(D类)LRRK2的蛋白质结构域，其中标记了ankryin（类Ank）重复区域、富含亮氨酸重复（LRR）结构域、GTPase结构域、MLK-like结构域和WD40结构域的位置。利用识别位点位于N端（JH5517和JH5518）或C端（JH2514和抗myc）附近的LRRK2特异性抗体，通过Western blotting分析瞬时表达myc标记的LRRK1（+）或空（-）载体的HEK-293T细胞裂解液。

**图2。**
WT和突变LRRK2的亚细胞定位。(A类)瞬时转染的HEK-293T细胞的代表性融合共聚焦图像。DAPI染色显示为蓝色，绿色表示LRRK2的myc-FITC抗体染色。（红色刻度条，10μm）(B类和C类)瞬时转染myc-tagged WT或突变LRRK2的HEK-293T细胞的亚细胞分离并通过Western blotting进行分析。通过剥离膜并用所示的标记抗体重制来评估每个组分的富集情况。每条车道装载两毫克蛋白质，并使用抗myc抗体评估LRRK2的表达。

**图3。**
WT和突变LRRK2的代谢。(A类)用5μM MG-132或50 mM氯化铵处理过度表达WT或突变LRRK2的SH-SY5Y细胞24 h，并通过Western blotting评估裂解产物。用抗myc抗体探测LRRK2，剥离膜并重新处理β-肌动蛋白。(B类)用myc-LRRK2与HA-ubiquitin共转染SH-SY5Y细胞，用或不用5μM MG-132处理24 h，并用抗c-myc抗体进行免疫沉淀。如图所示，用抗HA或抗c-myc抗体检测免疫沉淀物。

**图4。**
体外LRRK2激酶分析。(A类)通过SDS/PAGE和随后的银染分析从转染的HEK-293T细胞衍生的免疫沉淀LRRK2制剂。(B类)使用抗c-myc抗体通过Western blot评估WT或突变LRRK2蛋白水平。(C类)体外重组WT或突变LRRK2对生物素化MBP的激酶活性。合并³²MBP中的P通过液体闪烁进行评估，结果代表至少三个独立实验。误差线表示平均值±SEM.n.s.，不显著。^*,*P（P）*<0.05由双尾非配对学生的t吨测试。

**图5。**
LRRK2的自磷酸化。(A类)合并的自动放射自显影³²通过SDS/PAGE解析突变蛋白或WT-LRRK2重组蛋白中的P。(B类)用抗c-myc抗体进行Western blot分析，测定LRRK2蛋白水平。(C类)合并标准化³²P与LRRK2蛋白质含量相比。数据代表了至少三个独立的实验。a.u.，任意单位。误差线为平均值±SEM。^*,*P（P）*< 0.01;^**,*P（P）*<0.001由双尾非配对学生的t吨测试。

**图6。**
LRRK2 G2019S突变对激酶活性的假设作用。(A类)已知蛋白激酶激活片段的蛋白质比对。红色氨基酸代表bRaf蛋白的变化，该蛋白过度激活相应的激酶活性并易患癌症。绿色氨基酸代表LRRK2中与PD相关的突变。粗体氨基酸表示定义激活片段的保守蛋白质序列。(B类)一个^*表示G2019S突变在激活片段中的位置。该图改编自参考文献。

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中的注释

富含亮氨酸重复激酶2：帕金森病发病机制的一个熟悉主题的新参与者。
Li C、Beal MF。李C等。美国国家科学院院刊2005年11月15日；102(46):16535-6. doi:10.1073/pnas.0508350102。Epub 2005年11月7日。美国国家科学院院刊，2005年。采购管理信息：16275903 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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