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案例报告
.2005年10月;115(10):2784-92.
doi:10.1172/JCI26020。

在进行性脑病中线粒体复合物I组装的分子伴侣发生突变

附属公司
案例报告

在进行性脑病中线粒体复合物I组装的分子伴侣发生突变

奥格尔维岛等。 临床研究杂志. 2005年10月.

摘要

NADH:泛醌氧化还原酶(复合物I)缺乏是线粒体氧化磷酸化疾病的常见原因。它与婴儿的多种临床表型相关,包括Leigh综合征、心肌病和脑肌病。在至少一半的患者中,酶缺乏是由于未能组装全酶复合物所致;然而,组装哺乳动物酶所需的分子伴侣尚不清楚。使用带有和不带有复合物I的酵母的全基因组减法来生成候选装配因子,我们鉴定了B17.2结构亚基的副序列(B17.2L)。我们在一名进行性脑病患者的B17.2L中发现一个零突变,并表明相关的复合物I组装缺陷可以通过逆转录病毒在患者成纤维细胞中的表达而完全修复。抗B17.2L抗体与全酶复合物无关,但在一些具有复合物I组装缺陷的患者中特异性识别出830-kDa亚组分,并从正常人心脏线粒体共免疫沉淀出复合物I结构亚单位的子集。这些结果表明,B17.2L是一种真正的分子伴侣,对复合物I的组装和神经系统的正常功能至关重要。

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数字

图1
图1
人类B17.2和B17.2L预测蛋白序列的比对(A类)和B17.2L的多重对齐(B类)显示了酵母对人类蛋白质的保护作用。
图2
图2
B17.2L的线粒体定位和组织特异性表达(A类)用表达B17.2L-GFP融合蛋白的载体转染HEK293细胞,用线粒体标记物MitoTracker红染色,并在荧光显微镜下观察。这两个图像的叠加显示了这两个标记的完全重叠,显示了B17.2L的线粒体定位(B类)人体组织中B17.2L的免疫印迹分析。用抗B17.2L抗体通过免疫印迹分析测定正常人成纤维细胞(F)、心脏(H)、骨骼肌(M)和肝脏(L)中B17.2L的稳态水平。孔蛋白是一种线粒体外膜蛋白,与复合物I的49-kDa结构亚单位进行了比较。
图3
图3
分析B17.2升复杂I装配缺陷患者的基因。(A类)DNA序列分析B17.2升患者中显示C182T突变的cDNA。(B类)已预测B17.2升显示突变位置的基因结构和基因外显子2中预测的无义密码子。基因表示下面的灰色线表示B17.2结构域的位置。(C类)基于限制性内切酶的患者和父母基因组DNA外显子2突变分析。病人的突变破坏了限制酶的一个位点Taq1型.
图4
图4
患者成纤维细胞复合物I组装缺陷的抢救。(A类)患者中复合物I组装缺陷的BN-PAGE分析(泳道A)显示,与对照(泳道C)相比,通过凝胶内活性测定(上图)测量的酶的活性和通过使用抗ND1抗体的BN凝胶的免疫印迹分析(中间图)测量的全酶的量严重降低。用表达野生型的逆转录病毒载体转导患者细胞B17.2升cDNA(通道A+B17.2L)完全修复了生化缺陷。超复合体(复合体I和III)标记为α。下部面板显示负载控制的免疫印迹(复合物II的70-kDa亚单位)。(B类)用抗B17.2L抗体对成纤维细胞进行的免疫印迹分析显示,与对照组(C区)相比,患者成纤维细胞(A区)中完全没有全长B17.2L,并且用表达野生型的逆转录病毒载体转导后,蛋白质积累接近控制水平B17.2升cDNA(车道A+B17.2L)。
图5
图5
用BN-PAGE免疫印迹分析B17.2L的表达。(A类B类)对照组(C区)和患者(Be区、Br区和A区)肌肉的线粒体进行了一维BN-PAGE分析。凝胶被免疫印迹并与针对ND1的抗体反应(A类)或B17.2L(B类). 中的下部面板A类是负载控制的免疫印迹(复合物II的70-kDa亚单位)。(C类)患者成纤维细胞复合体I组装的BN-PAGE分析。从对照组和患者成纤维细胞中分离出线粒体,并进行二维BN-PAGE分析。使用针对所示蛋白质的抗体混合物来探测第二维免疫印迹。凝胶上标记为1-3的线分别表示复合物I-III超复合物、完全组装复合物I和830-kDa复合物III亚复合物的位置。位于49-kDa亚单位上方并与线3相交的点是一种由抗-49-kDa抗体识别的非特异性蛋白质。BI7.2L在对照组和患者F(涂片在凝胶的最右侧)中的分子量约为单体分子量,在已知结构亚单位基因突变(Be和Bo)的患者中,分子量为830-kDa的亚复合物I。(D类)第一维BN-PAGE凝胶显示患者Bo的肌肉线粒体中完全没有组装的复合物I。
图6
图6
患者成纤维细胞复合物I组装的BN-PAGE分析。从对照组和患者成纤维细胞中分离出线粒体,并进行一维BN-PAGE分析。对凝胶进行免疫印迹,并与ND1抗体反应(A类)和B17.2L(B类). 络合物I–III超复合体表示为α,830-kDa络合物I亚复合体和络合物III之间的超复合体显示为β。
图7
图7
从正常人心脏线粒体中免疫沉淀B17.2L和复合物I亚基的一个子集。从正常人心脏中分离线粒体,并用固定化的抗B17.2L抗体免疫沉淀。(A类)检测免疫沉淀物中是否存在B17.2L以及凝胶右侧显示的特定复合物I亚单位。复合物IV的亚单位COX-1和复合物II的亚单位SD70用于控制非特异性相互作用。Lane I显示了应用于固定化抗体的线粒体蛋白样本。Lane E代表洗脱与固定化抗体特异结合的蛋白质后获得的样品的一半。W巷显示了与洗脱液体积相同的最终清洗样品。(B类)通过免疫印迹的密度分析获得的抗B17.2L抗体免疫沉淀蛋白的定量分析。
图8
图8
患者A的脑部MRI。3岁、4个月大时拍摄的横向T2加权图像(A类B类). 10岁、3个月大时拍摄的横向液体衰减反转恢复(FLAIR)图像(C类D类).

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