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.2005年12月；16(12):5493-501.
doi:10.1091/mbc.e05-03-0268。 Epub 2005年9月21日。

PERK和GCN2在激活未折叠蛋白反应途径后促进eIF2α磷酸化和细胞周期阻滞

罗伯特·B·哈马纳卡 1, 贝斯·贝内特, 萨拉·B·库利南, J阿兰·迪尔
附属公司

PERK和GCN2在激活未折叠蛋白反应途径后促进eIF2α磷酸化和细胞周期阻滞

罗伯特·B·哈马纳卡等人。 分子生物学细胞. 2005年12月.

摘要

细胞暴露于内质网（ER）应激导致PKR-like ER kinase（PERK）激活、真核翻译起始因子2alpha（eIF2alpha）磷酸化、细胞周期蛋白D1翻译受到抑制，随后细胞周期阻滞在G1期。然而，PERK是否在未折叠蛋白反应途径（UPR）激活后单独负责调节细胞周期蛋白D1的积累尚未评估。在此，我们证明UPR激活后细胞周期蛋白D1翻译的抑制独立于PERK发生，但仍依赖于eIF2α磷酸化。尽管与野生型成纤维细胞相比，PERK-/-成纤维细胞中eIF2α的磷酸化减弱，但并未消除。残留的eIF2α磷酸化与细胞周期蛋白D1丢失的动力学相关，这表明另一个eIF2 alpha激酶在没有PERK的情况下发挥作用。在含有PERK和GCN2靶向缺失的细胞中，细胞周期蛋白D2丢失减弱，表明GCN2作为冗余激酶发挥作用。与这些结果一致，细胞周期蛋白D1的翻译在表达eIF2α非磷酸化等位基因的细胞中也稳定；相反，在这些细胞中仍然发生全局蛋白翻译的抑制，这突出了磷酸化eIF2α靶向翻译抑制的转录物的高度特异性。我们的结果表明，PERK和GCN2在UPR激活后协同调节eIF2α磷酸化和细胞周期蛋白D1翻译。

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数字

图1。
图1。
葡萄糖限制触发UPR激活和细胞周期蛋白D1丢失。（A） 用0.5μg/ml衣霉素（1-4道）、无葡萄糖培养基（5-8道）或10 mM 2-脱氧葡萄糖（9-12道）处理的非同步增殖NIH-3T3细胞制备的细胞裂解物，用针对细胞周期蛋白D1（顶部）、CDK4（第二组）、p27的抗体进行免疫印迹分析基普1（第三个面板）或CHOP（底部）。（B） 从在无葡萄糖培养基中培养指定时间间隔的细胞制备的裂解液用针对磷酸化（top）或总eIF2α的抗体进行Western分析。（C） 将未经处理的NIH-3T3细胞或在衣霉素、2-DOG或无葡萄糖培养基中培养20 h的细胞固定并用碘化丙啶染色，并用流式细胞术进行分析。插图中显示了含有2N DNA的细胞百分比。
图2。
图2。
在UPR激活期间，PERK对抑制细胞周期蛋白D1翻译不是必需的。（A） 在指定的时间间隔内，用0.5μg/ml衣霉素处理野生型或PERK–/–成纤维细胞。用细胞周期蛋白D1或CHOP特异性抗体对等量的总蛋白进行Western blot分析。（B） 用野生型或PERK–/–MEF制备的裂解液，在指定的时间间隔内用[35S] 用0.5μg/ml衣霉素处理蛋氨酸0、4或12h后，用正常兔抗血清（NRS）或细胞周期蛋白D1特异性单克隆抗体沉淀。沉淀蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术进行可视化。（C） 使用针对丝氨酸51磷酸化eIF2α或eIF2总α的抗体对如A所述制备的裂解液进行免疫印迹分析。通过密度测定法测定磷酸化eIF2α相对于总eIF2β的比率，并在每种细胞类型的未处理细胞中设置为1。
图3。
图3。
细胞周期蛋白D1的翻译抑制和随后的细胞周期阻滞依赖于eIF2α磷酸化。（A） 用0.5μg/ml衣霉素处理野生型或eIF2αS51A MEF指定时间间隔后，用细胞周期蛋白D1、CHOP或β-微管蛋白特异性抗体进行Western blot分析。（B） FACS分析用0.5μg/ml衣霉素处理的野生型或eIF2αS51A MEF的指定间隔。
图4。
图4。
用衣霉素处理缺乏PERK/GCN2/PKR的细胞后，细胞周期蛋白D1蛋白继续合成。（A） PERK/GCN2/PKR三敲除或野生型成纤维细胞在脉冲标记前用0.5μg/ml膜霉素处理[35S] 蛋氨酸。在用细胞周期蛋白D1特异性单克隆抗体或正常兔抗血清（NRS）沉淀进行代谢标记后，评估细胞周期蛋白D2的合成。（B） 通过TCA沉淀等浓度的总细胞裂解物来监测总蛋白合成。沉淀的蛋白质被发现在滤纸上，新的蛋白质通过闪烁计数定量。（C） 用0.5μg/ml衣霉素处理TKO或野生型成纤维细胞6小时，然后用[35S] 蛋氨酸用于指定的间隔。蛋白质浓度被归一化为TCA沉淀计数，每个脉冲长度的等效计数被免疫沉淀为细胞周期蛋白D1。（D） 用0.5μg/ml衣霉素处理TKO或野生型成纤维细胞。在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞裂解物后，通过Western分析评估细胞周期蛋白D1和β-微管蛋白水平。
图5。
图5。
GCN2与PERK协同抑制内质网应激后细胞周期蛋白D1的翻译。用0.5μg/ml衣霉素处理野生型、PERK–/–或PERK/GCN2–/–细胞，按照指定的时间间隔制备全细胞裂解物，在变性聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并用cyclin D1、CHOP或β-微管蛋白（a）和磷酸化eIF2α、总eIF2β或CHOP（B）特异性抗体进行Western blot分析。（C和D）野生型成纤维细胞被靶向GCN2的短发夹载体感染。感染后48小时，用2μg/ml衣霉素处理细胞，以指定的时间间隔，通过Western分析测定细胞周期蛋白D1、CHOP和hnRNPK的水平，并通过RT-PCR评估GCN2的敲除。
图6。
图6。
UPR激活不影响细胞周期蛋白D1的稳定性或转录。（A） 在30分钟脉冲前，用衣霉素处理TKO或野生型成纤维细胞0、2或4小时[35S] 蛋氨酸。细胞在含有过量冷蛋氨酸的培养基中按指定的时间间隔进行“追踪”。用D1单克隆抗体沉淀细胞周期蛋白D1，并通过放射自显影术观察。（B） 在指定的时间间隔内，用0.5μg/ml衣霉素处理TKO或野生型成纤维细胞。纯化总RNA，逆转录，PCR扩增细胞周期蛋白D1或HPRT的特异性信息。NRT表示无RT输入控制。（C） 在玻璃盖玻片上增殖的野生型、PERK–/–和PERK/GCN2–/–成纤维细胞未经处理或用衣霉素（0.5μg/ml）处理16 h。在最后1.5 h内，用BrdU对细胞进行脉冲处理；用免疫荧光法测定BrdU掺入量。条形图表示由三个独立实验确定的SD。
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