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.2005年11月；16(11):5304-15.
doi:10.1091/mbc.e05-06-0587。 Epub 2005年9月7日。

P54nrb与PSP1形成异二聚体，以RNA依赖的方式定位于副啄木鸟

Archa H狐狸 1, 查尔斯·邦德, 安格斯一世拉蒙德
附属公司

P54nrb与PSP1形成异二聚体，以RNA依赖的方式定位于副啄木鸟

Archa H狐狸等。 分子生物学细胞. 2005年11月.

摘要

P54nrb是一种参与多核过程的蛋白质，其特定功能可能与其在不同核位置的存在有关。在这里，我们描述了副啄木鸟的特征，副啄木鸟是一个包含p54nrb的亚核结构域，以及其他RNA-结合蛋白，包括PSP1，一种与p54nrl序列相似的蛋白质，它是副啄石鸟的标记。我们发现PSP1在体内与p54nrb总细胞库的一个子集相互作用。我们绘制了PSP1中介导这种相互作用的域，并表明PSP1对副啄木鸟的正确定位需要该域。这种相互作用对于PSP1的副啄靶是必要的，但还不足以实现，PSP1还需要能够与RNA结合的RRM。在有丝分裂结束时用DRB阻断RNA Pol II转录的再启动可防止副啄的形成，副啄在去除DRB后重新开始，这表明副啄形成依赖于RNA聚合酶II转录。因此，副啄鸟是p54nrb总细胞池的一个子集以RNA聚合酶II依赖性方式作为靶点的位置。

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数字

图1。
图1。
细胞周期中的副斑点。（A） HeLa的荧光显微照片YFP-PSP1α在16小时活细胞成像过程中获得的细胞（参见材料和方法). 有关电影，请参见补充视频1.mov。（B） 代表性活HeLa的荧光显微照片YFP-PSP1α细胞（YFP-PSP1，绿色信号）经双苯甲酰亚胺处理后标记DNA（蓝色信号），然后通过有丝分裂成像。（C） HeLa的DIC和荧光图像YFP-PSP1α作为活细胞时间进程成像实验的一部分获得的末期细胞。比例尺，10μm。箭头、副啄木鸟；箭头，核周帽。
图2。
图2。
DRB治疗的转录抑制延长了新分裂细胞中核周YFP-PSP1的出现，只有在药物被清除后才能形成副啄。活细胞成像HeLa获得的荧光显微照片YFP-PSP1α在7小时的过程中，每3分钟添加一次细胞。在实验开始时，细胞分裂后添加DRB，然后在细胞分裂后1小时22分钟删除DRB。比例尺，10μm。箭头、副啄木鸟；箭头，核周帽。电影请参见补充视频2.mov。
图3。
图3。
RNase A治疗消除副啄木鸟的YFP-PSP1α信号，但不消除核周帽。典型HeLa的荧光显微照片YFP-PSP1α电池（A和B）和HeLaYFP-PSP1α在与缓冲液（A和C）或含有RNase A（B和D）的缓冲液培养后，用ActD（C和D）预处理的细胞。蓝色，DAPI；绿色，YFP-PSP1。未进行Pyronin Y染色以确认核糖核酸酶A治疗的疗效（未公布的数据）。比例尺，10μm。箭头、副啄木鸟；箭头，核周帽。
图4。
图4。
PSP1区域需要定位到副啄木鸟和核周帽。顶部面板显示了在HeLa细胞中表达的PSP1突变体YFP融合物的定位模式摘要。下面是以HeLa（绿色信号）表达的YFP-PSP1突变体子集的代表性荧光显微图，并使用副啄标记（红色信号）进行免疫染色，副啄标志为PSP1（PSP1 Ab2，用于突变体a、B、D、E、F、G和K）或PSF（单克隆B92、YFP-PSP和突变体C和H）。副啄标记的选择取决于PSP1 Ab2所针对的肽表位的位置（在PSP1的C末端）；因此，由于抗体与过度表达的融合蛋白的交叉反应性，任何包含该区域的PSP1突变体都无法与内源性PSP1进行比较。ActD处理后突变定位模式的代表性荧光显微照片如补充图2所示。比例尺，10μm。“副斑点”定位被定义为与荧光强度为背景核质信号两倍以上的副斑点标记蛋白共同定位的多个核质焦点的形成。“cap”定位被定义为用ActD（1μg/ml）处理转染细胞4小时后出现核周cap。氨基酸替换突变由一个×表示，分别为F119A、F121A（RRM1）和K198A、F200A（RRM2）。
图5。
图5。
PSP1与体内p54nrb相关。（A） 使用两种不同的PSP1抗体（免疫前，第2道；抗体1，第3道；抗体2，第4道）从HeLa核提取物中免疫沉淀内源性PSP1。IP蛋白在4-12%SDS-PAGE上运行，并用胶体蓝染色。（B） 为了洗脱特定的PSP1复合物，用缓冲液（通道2和4）或每种抗体所针对的同源肽（Ab1肽，通道3和Ab2肽，通道5）培养IP结合珠。上清液进行SDS-PAGE，凝胶银染。（C） 用0.1-1 M NaCl/0.1-2%NP40反复清洗IP PSP1复合物（使用Ab2）（参见材料和方法). 结合蛋白进行SDS-PAGE并用胶体蓝染色。在所有面板中，分子量标记显示在通道1（kDa）中。（D） 使用瞬时表达YFP-p54nrb（泳道2）、YFP-PSP1（泳道3）或YFP（泳道4）的HeLa全细胞裂解物与抗GFP抗体进行IP。用SDS-PAGE分离得到的结合蛋白，并用抗PSP1抗体进行免疫印迹。“输入”（泳道1）是HeLa全细胞裂解物。
图6。
图6。
PSP1需要其卷曲线圈域来拉下p54nrb。瞬时表达YFP（第1道）、YFP-PSP1α（第2道）或YFP-PP1α突变（第3-13道）的细胞的全细胞裂解液用于IP和抗GFP抗体交联珠。然后将合成的结合蛋白进行SDS-PAGE，转移到硝化纤维素中，用p54nrb单克隆抗体（顶面板）或GFP单克隆抗体进行免疫印迹，使用ECL plus可视化信号。
图7。
图7。
PSF定位于副啄木鸟。面板显示了HeLa的荧光显微照片YFP-PSP1α细胞（YFP荧光为绿色信号；A和C），或HeLa细胞瞬时表达GFP-PSF（GFP荧光为绿色信息；B和D）。顶部面板（A和B）是未经处理的细胞，底部面板是用ActD（C和D）培养的细胞；参见材料和方法). 在每种情况下，用抗PSF（红色信号；A和C）或抗PSP1（红色信号，B和D）对细胞进行免疫染色。箭头、副啄木鸟；箭头，核周帽。所有面板中的蓝色信号为DAPI染色。比例尺，10μm。
图8。
图8。
当RNA Pol II转录被抑制时，PSP1和p54nrb结合，并在体外形成异二聚体。（A） 内源性PSP1及其伙伴蛋白（1-4道）和与珠结合的免疫沉淀蛋白（5-8道）IP前后（1道和3道）HeLa核提取物的Western blot。从对照HeLa细胞（通道1、2、5和6）和经ActD处理的HeLa电池（通道3、4、7和8）中制备提取物。为了监测ActD治疗的有效性，在细胞裂解前检查PSP1在核周帽的重新定位。免疫前血清（通道5和7）或PSP1 Ab2用于IP（通道6和8）。蛋白质提取物和洗涤珠经过SDS-PAGE，转移到硝化纤维素中，并用抗PSP1（顶面板）或抗p54nrb（底面板）进行Western印迹。使用ECL plus检测到信号。（B） 的裂解液大肠杆菌用pETDuet-His转化6-PSP1（61-328）/p54nrb（75-313）和诱导蛋白表达（参见材料和方法)用镍-淀粉负载，收集流通液（通道1），清洗色谱柱（通道2），用增加的咪唑洗脱馏分（通道3-8）。样品进行SDS-PAGE并用胶体蓝染色。分子量标记，泳道9（kDa）。
图9。
图9。
副啄鸟和核周帽中荧光-PSP1的不同动力学。该图显示了在30个瞬时表达PA-GFP-PSP1的不同HeLa细胞中，光活化的paGFP-PSP1蛋白从啄旁和核周帽结构中损失的组合数据（平均值和95%置信区间）（参见材料和方法). 对于每个时间点，减去背景（预激活）荧光，结果值表示为第一个激活荧光值的比率（即0 s时的值）。数据点通过最佳拟合曲线连接（2相指数衰减）。
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