STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx

doi:10.1016/j.cub.2005.05.055

比较研究

.2005年7月12日；15(13):1235-41.

doi:10.1016/j.cub.2005.05.055。

STIM是一种Ca2+传感器，对Ca2+存储耗尽触发的Ca2+内流至关重要

Jen Liou先生¹, Man Lyang Kim先生, Won Do Heo公司, 约书亚·T·琼斯, 杰森·迈尔斯, 詹姆斯·费雷尔, 拍卖师托比厄斯·迈尔

附属公司

PMID： 16005298
预防性维修识别码：项目经理186072
内政部： 2016年10月10日/j.cub.2005.05.055

比较研究

STIM是一种Ca2+传感器，对Ca2+存储耗尽触发的Ca2+内流至关重要

Jen Liou先生等。当前生物. 2005.

.2005年7月12日；15(13):1235-41.

doi:10.1016/j.cub.2005.05.055。

作者

Jen Liou先生¹, Man Lyang Kim先生, Won Do Heo公司, 约书亚·T·琼斯, 杰森·迈尔斯, 詹姆斯·费雷尔, 拍卖师托比厄斯·迈尔

附属

¹美国加州斯坦福大学医学院分子药理学系，邮编94305。

PMID： 16005298
预防性维修识别码：项目经理186072
内政部： 2016年10月10日/j.cub.2005.05.055

摘要

非兴奋细胞中的Ca（2+）信号通常由受体触发的肌醇-1,4,5-三磷酸的产生和细胞内储存的Ca的释放启动。一个难以捉摸的信号传递过程感测到Ca（2+）存储耗尽并触发质膜Ca（2+）通道的开放。由此产生的持续Ca（2+）信号是许多生理反应所必需的，例如T细胞激活和分化。在这里，我们监测了转染siRNAs的细胞中针对2304个人类信号蛋白的受体触发的Ca（2+）信号，并确定了Ca（2+）储存-完成介导的Ca的内流所需的两种蛋白，STIM1和STIM2。这些蛋白质具有一个跨膜区域，在内质网内腔中有一个假定的Ca（2+）结合域。Ca（2+）储存耗尽导致STIM1迅速移位到质膜附近积聚的点状物中。在STIM1 Ca（2+）结合结构域中引入点突变导致蛋白质在泪点中的预定位，并且该突变体未能对储存耗尽做出反应。我们的研究表明，STIM蛋白在连接Ca（2+）储存耗尽和Ca（2+）内流的信号通路中作为Ca（2+）储存传感器发挥作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。STIM1和STIM2在动力学钙中确定²⁺2304人信号siRNA抑制SOC流入的筛选**
（A）钙的比较²⁺STIM1敲除细胞的时间进程为平均参考时间进程。用平均浓度为10 nM的siRNA信号转染HeLa细胞2天。呋喃-2钙²⁺在具有自动刺激添加的微板读取器中测量时间进程。（B）相对Ca的位置热图分析²⁺含有STIM1和STIM2 siRNA转染细胞的两个微孔板的平台值（每个板24个重复siRNA）。相对Ca²⁺平台值是通过将平台（最后5个数据点的平均值）除以荧光峰值（3个峰值点的平均）来计算的。（C） STIM1和STIM2的域结构。结构域包括一个EF-hand基序（EF）、一个SAM结构域、一个跨膜结构域（TM）和一个ERM结构域，该结构域从两种蛋白质的N到C末端排列，C末端位于胞浆中。（D–F）钙的抑制²⁺用“Ca²⁺转染10 nM STIM1和/或10 nM STIM2 siRNA 2天的HeLa细胞中的add-back”。使用100微摩尔组胺加上两微摩尔毒肽（D）、单独组胺（E）或单独毒肽（F）来消耗钙²⁺商店。（G） STIM1 siRNA的滴定。所有带有对照siRNA的样品的总siRNA浓度保持在20 nM。（H）Ca的近完全抑制²⁺用20 nM STIM1加20 nM ST IM2 siRNA转染细胞3天内的内流。（D）-（H）中的数据是3个体积细胞Ca的平均值²⁺用微孔板阅读器获得的测量值。（一）抑制T细胞受体触发的钙²⁺STIM1 siRNA.Ca流入²⁺在转染pYFP-Nuc（转染标记）和72 nM STIM1或对照siRNA的Jurkat T细胞上进行2天的补充实验。钙²⁺用20μg/ml抗人CD3抗体耗尽储存。所示为平均Ca²⁺48个对照细胞和84个STIM1 siRNA-转染（YFP-阳性）单细胞的反应。

**图2。STIM调节SOC流入**
（A）钙的直接测量²⁺Mn流入²⁺淬火试验。用20 nM对照或10 nM STIM1和10 nM SCIM2 siRNA的混合物转染HeLa细胞2天。2毫摩尔Mn²⁺图像采集前添加100μM组胺，50 s后添加2μM thapsigargin。左边的面板显示了在对照细胞和STIM敲除细胞中使用360 nm激发作为时间函数测量的相对Fura-2荧光强度。每个轨迹代表三个单独实验的平均淬火响应，每个实验分析660-1300个单个细胞。使用Matlab程序计算每个细胞在添加刺激之前（4–44 s）和之后（100–140 s）的ΔF/F猝灭率。平均ΔF/F显示在右侧的条形图中。（B） YFP-STIM1的过度表达增加了SOC流入。用40 ng YFP-STIM1或对照载体转染HeLa细胞1天后，对其进行锰处理²⁺如（A）中所述的骤冷测定。SOC内流抑制剂SKF 96365在20μM下使用。每个数据集分析了150多个单个细胞。误差线为95%置信区间。

**图3。STIM1传感器ER Ca²⁺耗尽及其亮度EF-Hand**
（A） YFP-STIM1在Ca后重新分布为点状结构²⁺存储耗尽。用YFP-STIM1和CFP标记的ER标记物共同转染HeLa细胞。在组胺和thapsigargin刺激前（前两个面板）和刺激后8分钟（后两面板）分别拍摄同一细胞的CFP/YFP共聚焦图像。箭头指向点缀丰富的外围站点。右侧放大的面板显示了刺激前STIM1与ER标记的共定位。（B） STIM1的EF-hand突变体已经定位于puncta，并且对存储耗尽没有反应。HeLa细胞与YFP-STIM1（D76A）和CFP-ER标记物共转染。在组胺和thapsigargin刺激前（前两个面板）和刺激后8分钟（后两面板）分别拍摄同一细胞的CFP/YFP共聚焦图像。比例尺代表10μm。（C）表达EF-hand突变体的STIM1敲除细胞在刺激前内流增加，对钙无反应²⁺存储耗尽。锰²⁺对转染40 nM STIM1 UTR或对照siRNA加YFP-STIM1（D76A）或YFP载体的HeLa细胞进行猝灭试验，如图2A所示。误差线为95%置信区间。

**图4。STIM1以两种定位状态存在，并在Ca后迅速重新分布到质膜附近的Puncta中²⁺商店消耗**
（A） Ca后STIM1野生型和EF-hand突变的克隆化²⁺存储耗尽。HeLa细胞与CFP-STIM1和YFP-STIM1（D76A）共转染。在组胺和thapsigargin刺激前（顶部两个面板）和刺激后2.5分钟（底部两面板），在同一细胞的粘附表面附近拍摄CFP/YFP共聚焦图像。右侧放大的面板显示了STIM1点的形成以及野生型和EF-hand突变型STIM1在Ca后的共定位²⁺存储耗尽。（B） TIRF显微镜显示，许多YFP-STIM1点状物在质膜100 nm范围内迅速形成。HeLa细胞与YFP-STIM1和CFP-CAAX共转染。在组胺和thapsigargin刺激后的不同时间点，在同一细胞内拍摄CFP/YFP TIRF图像。比例尺表示10μm。（C）近质膜YFP-STIM1斑点中平均相对荧光强度的动力学分析（n=212；显示指数拟合）。

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