跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2005年6月29日；25(26):6156-66.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1017-05.2005。

Sortilin控制脑源性神经营养因子向调节分泌途径的细胞内分选

陈哲余 1, 亚历山德罗·伊拉西, 亨利·滕, 亨宁·达尔, 崔祥梦, 丹尼尔·G·埃雷拉, 安德斯·尼克贾尔, 芭芭拉·伦普斯特德, 弗朗西斯·S·李
附属公司

Sortilin控制脑源性神经营养因子向调节分泌途径的细胞内分选

陈哲余等。 神经科学. .

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）在神经元活性依赖性分泌后，调节关键的神经系统功能。最近，人类bdnf基因的一个变体导致前体蛋白中缬氨酸到蛋氨酸的替代，已被证明会导致神经元调节分泌缺陷和记忆障碍。在这里，我们报道了Vps10p结构域蛋白sortilin在控制BDNF分选到调节分泌途径中的新功能。Sortilin在蛋氨酸替代区域与BDNF特异性相互作用，并在神经元分泌颗粒中与BDNF.共定位。sortilin的截短形式导致BDNF在不影响神经营养因子-4（NT-4）分泌的情况下向组成型分泌途径错配。此外，引入初级神经元的sortilin小干扰RNA也导致BDNF从调节分泌途径错配到组成分泌途径。总之，这些数据表明了理解与变异BDNF相关的缺陷的机制，并提供了一个基于对分泌途径分类的不同突触前调节的框架，以解释原肌球蛋白相关激酶B的两种配体BDNF和NT-4如何介导不同的生物反应。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
sortilin与野生型和变异BDNF的共免疫沉淀。A类，HEK 293细胞与编码sortilin和C末端BDNF的cDNA共转染瓦尔-HA或BDNF遇见-HA或空向量（-）。细胞裂解物用HA抗体免疫沉淀，用分拣素抗体免疫印迹（顶部）。BDNF-HA的免疫沉淀（IP）经HA抗体免疫印迹证实（中）。粗裂解物用sortilin抗体和HA抗体进行免疫印迹，以确认等效表达水平（底部）。B类,体外结合试验。GST-BDNF公司瓦尔、GST-BDNF遇见或GST-NT-4前体融合蛋白与过度表达全长sortilin的HEK 293细胞的裂解物孵育。用抗皮质素抗体免疫印迹法检测结合的索氨酸。
图2。
图2。
定位sortilin与BDNF突变体的相互作用。A类用sortilin和全长BDNF或NT-4或截断突变体共同转染HEK 293细胞。用HA抗体对裂解液进行免疫沉淀，用sortilin抗体进行免疫印迹（顶部）。用HA抗体免疫印迹证实BDNF-HA的免疫沉淀（中间）。Sortilin的表达通过Sortilin抗体进行验证（下图）。B类，顶部面板中蛋白质印迹的定量A类作为突变体神经营养因子与野生型BDNF相比的sortilin共免疫沉淀（Co-IP）的百分比。通过三个独立实验的分析确定平均比例±SEM。C类，BDNF和NT-4突变体概述A类以及对sortilin与突变BDNF和NT-4相互作用的总结。免疫沉淀；wt，野生型；m、 成熟。
图3。
图3。
绘制BDNF与sortilin突变体的相互作用。A类，tSort与BDNF的共免疫沉淀。将HEK 293细胞与编码突变的截短分拣蛋白或全长分拣蛋白的cDNA以及C末端标记的BDNF-HA共同转染。细胞裂解物用HA抗体免疫沉淀，用分拣素抗体免疫印迹（顶部）。用HA抗体免疫印迹证实BDNF-HA的免疫沉淀（中间）。粗裂解物用sortilin抗体进行免疫印迹，以确认等效表达水平（底部）。B类BDNF与sortilin的内源性关联。P10海马和皮层裂解物用抗BDNF抗体或正常兔IgG进行免疫沉淀，并用亲和素抗体进行免疫印迹（顶部）。BDNF的免疫沉淀通过BDNF抗体的免疫印迹得到证实（中间）。粗裂解物用分拣素抗体进行免疫印迹，以确认等效蛋白负荷（底部）。C类，BDNF的组成性分泌，在缺乏或存在截短的分拣蛋白的情况下。用编码GFP或tSort的重组腺病毒感染稳定表达proBDNF的HEK 293细胞，感染倍数为1。感染48小时后收集培养基（每车道25μg），并用BDNF和sortilin抗体进行免疫印迹。Wt，野生型；免疫沉淀；河马，海马；Con，控制。
图4。
图4。
变异型和野生型BDNF与sortilin的亚细胞共定位。A类分化后的PC12细胞转染N末端HA标记变异体（Met）或野生型BDNF（Val）。48小时后固定细胞并渗透。BDNF和sortilin的克隆化通过与抗HA和抗皮质素抗体结合来观察。此外，未转染分化的PC12细胞在48小时后固定并渗透。通过与抗皮质素和抗SecII抗体共染，可以观察到内源性sortilin和SecII的Colocalization。显示了典型的外荧光图像。B类用N-末端HA标记变异体（Met）或野生型BDNF（Val）和Myc-tagged sortilin转染海马神经元。48小时后固定细胞并渗透。如材料和方法中所述，使用表位抗体，通过共聚焦显微镜观察HA-BDNF和Myc-sortilin的共定位。使用MAP2抗体确认所有神经元。此外，未转染的神经元在48小时后固定并渗透。通过与抗皮质素和抗SecII抗体共染，可观察到内源性sortilin和SecII的克隆化。显示了典型的外荧光图像。比例尺，20μm。
图5。
图5。
截短的sortilin改变细胞内BDNF靶向分泌颗粒。A类，分化后的PC12细胞与全长或截短的Myc-标记的sortilin以及N-末端HA-标记的BDNF共同转染瓦尔或BDNF遇见48h后细胞固定并渗透。通过与抗HA、抗Myc抗体和抗SecII抗体结合，可以观察到sortilin（全长，截断）、BDNF和SecII的定位。显示了典型的外荧光图像。B类，海马神经元与截短的Myc-tagged sortilin和N-末端HA标记的BDNF共同转染。48小时后固定细胞并渗透。BDNF和SecII的定位是通过与抗HA、抗SecII抗体和抗MAP2抗体结合来实现的。通过与抗HA、抗Myc抗体和抗SecII抗体共染色，观察截短的sortilin、BDNF和SecII的定位。显示了典型的外荧光图像。比例尺，20μm。
图6。
图6。
BDNF前体蛋白在活性依赖性BDNF分泌中的作用。A类在转染N末端HA-BDNF的PC12细胞中表达含有BDNF前体差异区域（Box1、Box2、Box3、Box2+3）的慢病毒构建物，该区域融合到GFP或GFP单独。48小时后，在材料和方法中描述的去极化分泌条件下收集培养基，并用ELISA进行分析。结果显示为六个独立实验测定的平均值±SEM(**第页< 0.001; 学生的t吨测试）。B类，用缺乏前体蛋白某些区域的BDNF突变形式转染分化的PC12细胞（ΔBox1，ΔBox2′，ΔBox3，ΔBox2+3）。48小时后，在材料和方法中描述的去极化分泌条件下收集培养基，并用ELISA进行分析。结果显示为六个独立实验分析得出的平均值±SEM(**第页< 0.001; 学生的t吨测试）。WT，野生型。
图7。
图7。
截短的sortilin选择性地改变活性依赖性BDNF分泌。A类在存在或不存在tSort的情况下，用NT-4转染分化的PC12细胞。48小时后，如材料和方法中所述，在去极化和组成型分泌条件下收集培养基，并通过ELISA进行分析。在存在或不存在全长sortilin（Sort）或tSort的情况下，用BDNF转染分化的PC12细胞。48小时后，在去极化状态下收集培养基(B类)和组成性分泌物(C类)条件，如材料和方法中所述，并通过ELISA分析。所有结果均表示为六个独立实验分析得出的平均值±SEM(*第页< 0.01;**第页< 0.001; 学生的t吨测试）。
图8。
图8。
截短的sortilin和sortilin-siRNA选择性地改变活性依赖的BDNF分泌。在存在或不存在全长sortilin（Sort）、tSort或sortilin-siRNA（siSort）的情况下，用BDNF转染海马皮层神经元。3天后，在去极化条件下收集培养基(A类)和组成性分泌物(B类)条件，如材料和方法中所述，并通过ELISA分析。所有结果均表示为六个独立实验分析得出的平均值±SEM(*第页< 0.05;**第页< 0.01; 学生的t吨测试）。C类，在有或无sortilin siRNA的情况下转染海马皮层神经元。3天后，按照材料和方法中的描述，对细胞裂解液进行sortilin-微管蛋白（负载控制）免疫印迹。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Berg EA、Johnson RJ、Leeman SE、Boyd N、Kimerer L、Fine RE（2000）《从兔视神经和末端分离和鉴定含P物质的致密核心小泡》。神经科学研究杂志62:830-839。-公共医学
    1. Berkemeier LR，Winslow JW，Kaplan DR，Nikolics K，Goeddel DV，Rosenthal A（1991）神经营养素-5：一种激活trk和trkB的新型神经营养因子。神经元7:857-866。-公共医学
    1. Chao MV（2003）《神经营养素及其受体：许多信号通路的汇合点》。《国家神经科学评论》4:299-309。-公共医学
    1. Chen ZY，Patel PD，Sant G，Meng CX，Teng KK，Hempstead BL，Lee FS（2004）变异脑源性神经营养因子（BDNF）（Met66）改变神经分泌细胞和皮层神经元中野生型BDNF的细胞内转运和活性依赖性分泌。神经科学杂志24:4401-4411。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Egan M、Kojima M、Callicott J、Goldberg T、Kolachana B、Bertolino A、Zaitsev E、Gold B、Goldman D、Dean M、Lu B、Weinberger D（2003）。BDNF val66met多态性影响BDNF的活动依赖性分泌、人类记忆和海马功能。手机112:257-269。-公共医学

出版物类型

MeSH术语