Distinct structural domains within C19ORF5 support association with stabilized microtubules and mitochondrial aggregation and genome destruction

doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-3865

.2005年5月15日；65(10):4191-201.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-3865。

C19ORF5内不同的结构域支持与稳定微管、线粒体聚集和基因组破坏的关联

刘乐源¹, 艾米·沃伊, 刘国钦, 华莱士·L·麦基汉

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C19ORF5内不同的结构域支持与稳定微管、线粒体聚集和基因组破坏的关联

刘乐源等。癌症研究. 2005.

.2005年5月15日；65(10):4191-201.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-3865。

作者

刘乐源¹, 艾米·沃伊, 刘国钦, 华莱士·L·麦基汉

附属

¹美国德克萨斯州休斯顿市德州农工大学系统健康科学中心生物科学与技术研究所癌症生物与营养中心，邮编77030。

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摘要

C19ORF5是微管相关蛋白MAP1A/MAP1B的序列同源物，功能未知，但与线粒体相关蛋白、类紫杉醇微管稳定剂和候选肿瘤抑制因子RASSF1A相关。这里，我们表明，当在哺乳动物细胞中过度表达C19ORF5（C19ORF 5C）的重组393氨基酸残基COOH末端时，显示出与表达水平成比例的四种分布模式。虽然C19ORF5C正常分布在整个细胞液中，没有微管结合，但在紫杉醇处理的细胞中，C19ORF 5C特异性地积聚在稳定的微管上，并在体外与紫杉醇稳定的微管直接相互作用。天然的113-kDa全长C19ORF5和较短的56-kDa形式与肝细胞中稳定的微管以及来自其裂解物的稳定微管类似。随着C19ORF5的积累，它出现在线粒体上，并逐渐诱导线粒体的核周聚集。C19ORF与细胞色素c缺乏的线粒体重叠，膜电位降低。线粒体聚集导致DNA严重降解，这是一个与细胞死亡相关的过程，我们称之为线粒体聚集和基因组破坏（MAGD）。缺失突变表明，C19ORF5超稳定微管结合域位于<100个残基的高度碱基序列中，而MAGD活性则位于下游的一个分泌物中nct第25页-残留序列（F967-A991）。我们的结果表明，C19ORF5通过不同的双功能结构域介导微管细胞骨架和线粒体之间的通讯，以控制细胞死亡和缺陷基因组的破坏。C19ORF5的积累和由此产生的由超稳定微管信号传导的MAGD可能参与RASSF1A的肿瘤抑制活性，RASSF1A是一种天然的微管稳定剂和与C19ORF5的相互作用伙伴，以及紫杉类药物家族。

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数字

图1
GFP-C19ORF5C的细胞分布模式。A类，转染GFP-C19ORF5C的COS7细胞中GFP分布的四种一般形态学特征。根据与点状聚集体的相关性增加，细胞被分类为I型至IV型。细胞边界通过光学显微镜定位，然后通过最大限度地增加暴露时间来确定，以检测整个视野中的总GFP信号。转染后的细胞外围轮廓如图所示。然后减少场曝光，以促进高强度点状结构的最大分辨率。所有显微照片中的10μm条。B类，II型至IV型细胞的时间依赖性增加，表现出GFP-C19ORF5C的点状聚集体。柱，来自三个独立实验的I型至IV型细胞的平均计数，其中在指定的时间对50个显微镜视野中的至少500个总转染细胞进行计数；酒吧正常培养基含有5%胎牛血清。*旧金山*，无血清培养基。显示常规凋亡形态学的细胞数量(*A、（f）*)在单独转染GFP的培养物中得分(*开放式列*).C类GFP-C19ORF5C在室温下单个转染细胞中的时间依赖性核周聚集。在指定的时间从连续观察的单个细胞中捕获图像。重复观察的代表细胞和表达GFP-C19ORF5C或GFP的单个细胞中GFP荧光强度的时间依赖性增加。相对荧光强度是通过将细胞内荧光最亮的场中任意单位的平均荧光强度除以细胞边界外相同大小场的平均荧光密度来确定的。D类直接分析转染细胞中的总GFP-C19ORF5或GFP、β-微管蛋白和β-肌动蛋白。GFP-C19ORF5C或GFP转染的COS7细胞培养于25 cm²培养基中的组织培养瓶(N个)或不含5%胎牛血清(*旧金山*)持续28小时。提取物由8×10制成⁵将收集的细胞刮入200μL缓冲液I中。将等量的可溶性蛋白（160μg）施加于SDS-PAGE的每条通道，电泳转移后，用1μg/mL抗GFP的多克隆抗体或抗β-微管蛋白或β-肌动蛋白的单克隆抗体检测GFP-C19ORF5C、GFP、微管蛋白和肌动蛋白。用0.1βg/mL碱性磷酸酶结合的抗兔IgG或抗鼠IgG抗体观察条带。

图2
C19ORF5与紫杉醇稳定微管的特异性关联。A类纯化GST-C19ORF5C与紫杉醇稳定微管的结合。将微管蛋白（10μg）与10μg GST-C19ORF5C、GST或其他对照GST融合蛋白在37°C的g-PEM缓冲液中在5μmol/L紫杉醇的存在下培养30分钟。将20μL混合物分层于10μL 10%蔗糖溶液中的PEM缓冲液中，并在10000×克在室温下保持20分钟。上清液(*S公司*，30μL），含有可溶性微管蛋白和其他相对低分子量成分和颗粒(*P（P）*)在含有稳定微管和相关蛋白的30μL G-PEM缓冲液中再次悬浮，并在7.5%SDS-PAGE上并排加载。考马斯蓝染色显示蛋白质条带。B类GST-C19ORF5C蛋白与微管的紫杉醇浓度依赖性关联。在相同数量的GST-C19ORF5C和微管蛋白存在下组装微管(A类)含有指定量的紫杉醇。C类C19ORF5与紫杉醇稳定微管的特异性结合体内用10μmol/L紫杉醇处理COS7细胞，转染GFP-C19ORF5C编码的cDNA时，用抗β-微管蛋白和德克萨斯红结合抗鼠抗体染色。GFP的关系(绿色)和抗β-微管蛋白抗体(红色)观察荧光并合并颜色以测试信号重叠(*黄色的*).合并2，中的单元格段*合并1*放大2.5倍。代表三个独立实验中90%的转染细胞。D类，正常情况下天然C19ORF5的分布(一)和紫杉醇处理的HepG2细胞(b条)及其与来自HepG2细胞裂解物的紫杉醇稳定微管的关联*在体外*(*c（c）*). 用紫杉醇处理细胞，并用mAb4G1进行分析。代表三个独立实验中的大多数细胞。对于*在体外*微管组装，~1×10⁶HepG2细胞在150μL缓冲液中溶解，然后超声处理10秒。细胞裂解液通过10000×离心澄清克持续20分钟，并在37°C下用10μmol/L紫杉醇处理1小时以稳定微管，将反应混合物加载在20%蔗糖的20μL缓冲垫上。通过100000×克持续1小时。将含有稳定微管的颗粒重新悬浮在150μL缓冲液中。在SDS-PAGE上分析等体积颗粒和上清液（25μL）组分，并分别用C19ORF5（mAb4G1）或β-微管蛋白抗体进行免疫印迹。*佛罗里达州*，cDNA预测全长C19ORF5；*联合国安全理事会*，短链。

图3
C19ORF5导致的MAGD。A类GFP-C19ORF5C与I型至IV型细胞线粒体的关系。确定细胞边界，然后按图1所示进行概述。绿色绿色荧光蛋白信号(一)与红色MitoTracker合并(b条)在合并中(*c（c）*).黄色GFP信号与线粒体重叠。B类GFP-C19ORF5C相关线粒体与细胞色素c的关系。为了获得最大的颜色对比度，GFP-C19 ORF5c发出的强GFP信号被人为指定为蓝色。细胞色素c信号为绿色。蓝色GFP-C19ORF5C与红色MitoTracker、红色MitoTracker与绿色细胞色素c或蓝色GFP-C19ORF5C与绿色细胞素c的重叠在Merge中用紫色、黄色或青色表示*d、 e（电子）*，或*（f）*分别是。C类微管塌陷和DNA降解与C19ORFC相关线粒体聚集的巧合。来自GFP-C19ORF5的绿色GFP信号(一)用红β-微管蛋白免疫化学染色进行分析(b条)在合并中(*c（c）*)和蓝色DAPI DNA染色(d日)在合并2中(*e（电子）*). Merge中的黄色表示GFP信号与微管蛋白重叠，Merge 2中的青色表示GFP与DAPI重叠。如材料和方法所述，通过免疫分析观察微管。显示仅转染GFP的对照细胞。

图4
C19ORF5 COOH末端内超稳定微管结合域的鉴定*体外试验。A类*、结构的顺序和属性。所示结构在NH处与GST或GFP融合₂终点站。如材料和方法所述，使用谷胱甘肽和DNA亲和力表达、回收和纯化GST融合物。编号根据C19ORF5的全长cDNA进行，C19ORF5是NH处氨基酸的单字母编码₂-以及产物的COOH末端残基，并且指示总残基。右边概述了建筑产品的物理化学和功能特性。使用基于Web的工具计算理论pI值http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html.妈妈微管结合活性；*MAGD公司*，细胞毒性MAGD活性；第，未确定。B类，与紫杉醇稳定的微管结合*在体外*如图1所示，确定所示结构与由微管蛋白组装而成的紫杉醇稳定微管的关联A类55-kDa条带为微管蛋白，37-kDa或更小的条带为GST融合蛋白，其低分子量截短。如材料和方法所示，A867-E966构建体的纯化产物≤34kDa。从细菌中回收纯化GST-标记F967-F1059的能力不足，无法进行评估*在体外*纯化的GST-S767-E966分子量为47kDa，与SDS-PAGE上的微管蛋白重叠，未显示。*P（P）*，含有微管的颗粒；*S公司*，上清液含有未聚合的微管蛋白。C类，确认C19ORF5中的超稳定微管结合域。NH处用GFP转染指定结构的COS细胞₂用紫杉醇处理末端，检测细胞绿色GFP信号与超稳定微管的相关性以及与红色抗β-微管蛋白的重叠，如图2所示。在至少三个独立的实验中，对近100%的前四种结构的转染细胞、90%的F967-F1059转染细胞和10%的F967-2000转染细胞进行了检测。

图5
独立MAGD域的标识。A、 C19ORF5C子域GFP标记结构编码分析。在NH用GFP转染COS细胞₂末端和细胞用MitoTracker和DAPI染色。转染24小时后，以与GFP-C19ORF5C相同的方式检查培养物的I型至IV型表型。合并1中的黄色和合并2中的青色表示重叠绿色GFP-C19ORF5C和线粒体(红色)或DNA(蓝色)分别是。每个转染培养物中的代表细胞。仅在以图1中GFP-C19ORF5C所述的相对频率转染F967-F1059的培养物中观察到II型至IV型细胞形态。代表性I型和III型电池。B类，将MAGD域还原为25个残基序列。对COOH末端序列缺失的含有MAGD结构域的GFP-F967-F1059的指示结构进行测试，以诱导指示MAGD活性的II型至IV型表型。反义，GFP的编码序列与F967-A991的帧内反义编码序列融合。

图6
C19ORF5的COOH末端的功能序列域与MAP1A和MAP1B轻链序列的比较。A、 C19ORF5的序列域结构。指出了本研究中使用的全长C19ORF5和393氨基酸残基C19ORF 5C（D667-F1059）以及残基侧翼结构。A867-S945表示高度碱性的微管结合域。F967-A991是MAGD域。B类人C19ORF5与MAP1A（MAP1A-LC2）和MAP1B（MAP1B-LC1）轻链的序列比对。所有三个序列中的相同残基均为黑色。*虚线条*(顶部)，包含微管结合域的C19ORF5序列A867-E966；*底部实线*，MAP1B的微管结合结构域（45）；*顶部实心钢筋*，C19ORF5的MAGD域。

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