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.2005年8月1日；389（第3部分）：629-36。
doi:10.1042/BJ20050067。

生长因子诱导Hrs-STAM复合物的不同磷酸化谱：具有信号特异性的信号网络中的一个常见节点

Paula E Row公司 1, 迈克尔·克拉格, 西尔维·乌尔贝
附属公司

生长因子诱导Hrs-STAM复合物的不同磷酸化谱：具有信号特异性的信号网络中的一个常见节点

Paula E Row公司等。 生物化学杂志. .

摘要

Hrs（肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物）和STAM（信号转导接合器分子）形成一种异二聚体复合物，与内胚层膜相关，并在多种生长因子（包括表皮生长因子（EGF）、肝细胞生长因素（HGF））的作用下被酪氨酸磷酸化血小板衍生生长因子（PDGF）。Hrs-STAM复合物的磷酸化需要受体内吞。我们表明，Hrs内完整的UIM（泛素相互作用基序）是EGF和HGF刺激下游Hrs磷酸化的保守要求。与此一致的是，E3泛素连接酶的显性负形式c-Cbl的表达抑制EGF-和HGF-依赖性Hrs的磷酸化。尽管如此，使用PP1（4-氨基-5-（4-甲基苯基）-7-（叔丁基）吡唑并[3,4-d]嘧啶）和SU6656的激酶抑制剂图谱表明，不同的非受体酪氨酸激酶将EGF、HGF和PDGF刺激与Hrs-STAM复合物的酪氨酸磷酸化偶联。至关重要的是，对磷酸特异性抗体的分析表明，这些激酶产生Hrs-STAM复合物的信号特异性组合磷酸化谱，具有通过一个共同元素使酪氨酸激酶受体信号多样化的潜力。

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数字

图1
图1。EGF-和HGF-介导的Hrs酪氨酸磷酸化对小时UIM的常见要求
(一)用GFP–Hrs或Hrs–UIM突变体GFP–LSAA转染HeLa细胞，并在16 h饥饿期后用EGF（100 ng/ml）或HGF（250 ng/ml）刺激转染后22 h。GFP–Hrs被免疫沉淀，酪氨酸磷酸化通过PY20抗体（P-Tyr）免疫印迹进行评估。用抗GFP抗体进行免疫印迹分析如上所述制备的裂解液。(b条)致癌Cbl突变体干扰Hrs磷酸化。用GFP–Hrs和pCDNA3.1控制载体（V）、HA标记的c-Cbl或70Z-Cbl转染HeLa细胞，然后在16 h饥饿期后用EGF或HGF刺激转染后22 h。对GFP–Hrs进行免疫沉淀，用对-Tyr进行免疫印迹分析样品，并用抗Hrs抗体进行重复。用抗-Hrs或抗-HA抗体通过免疫印迹分析如上所述制备的裂解液样品，以评估相对表达水平（注意，*表示的带对应内源性Hrs）。
图2
图2。c-Cbl和70Z-Cbl突变体表达细胞中EGFR和GFP–Hrs的共定域
将HeLa细胞接种在盖玻片上，并用GFP–Hrs和pCDNA3（对照）、HA标记的c-Cbl或70Z-Cbl转染，然后在16小时饥饿期后转染后22小时用100 ng/ml EGF刺激8分钟。用3%多聚甲醛固定细胞，用Triton X-100渗透，用抗EGFR（EGFR以红色显示）染色，然后用二级抗体与Alexa Fluor 594偶联。所有面板都显示一个共焦截面。比例尺，20μm。
图3
图3。Hrs和STAM对EGF和组成活性Src的酪氨酸磷酸化反应的比较
用组成活性Y527F-Src（Src）或pCDNA3.1（–）转染HeLa细胞，在无血清培养基中饥饿16 h，然后用EGF（100 ng/ml）刺激转染后22 h持续8 min。(一)用抗Hrs抗体对裂解液进行免疫沉淀，并用PY20抗体（P-Tyr）或抗PY334-Hrs抗体进行免疫印迹（IB）分析。将印迹剥离并用抗Hrs抗体重新处理。(b条)用抗STAM抗体对裂解液进行免疫沉淀，并用对-Tyr或抗PY198-STAM抗体进行免疫印迹分析。剥离印迹，并用抗STAM抗体重制。
图4
图4。Src-激酶抑制剂对EGF-、HGF-和PDGF-刺激的Hrs和STAM磷酸化的差异作用
(一)HeLa细胞或(b条)HER14细胞无血清培养16 h，用2μM SU6656（SU）或载体预培养1 h或用2.5μM PP1预培养15 min，并用EGF（100 ng/ml）、HGF（250 ng/ml。用抗Hrs抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，用PY20抗体（对-Tyr，顶面板）进行免疫印迹评估酪氨酸磷酸化。请注意，上带对应于磷酸盐-Hrs，下带对应于共沉淀磷酸盐-STAM。剥离印迹，并用抗Hrs抗体进行重制（底部面板）。(c（c）,d日)裂解物，由处理为(一,b条)用对-Tyr抗体直接进行免疫印迹分析，显示酪氨酸磷酸化谱发生改变（箭头）。
图5
图5。Src-激酶抑制剂存在下EGFR和PDGFR的磷酸化和泛素化
HER14细胞无血清培养16小时，用2μM SU6656或载体预培养1小时或用2.5μM PP1预培养15分钟，并用(一,c（c）)100 ng/ml EGF或(b条,d日)30 ng/ml PDGF，在37°C下保持8分钟。细胞裂解物经免疫沉淀(一,c（c）)抗EGFR或(b条,d日)抗PDGFR抗体。分别用PY20抗体（P-Tyr）和抗泛素抗体评估磷酸化和泛素化。用抗EGFR或抗PDGFR抗体（底部面板）重制印迹。
图6
图6。Src-激酶抑制剂存在下内化EGFR与Hrs的共定标
将HeLa细胞接种在盖玻片上，无血清培养16 h，用2μM SU6656或载体预培养1 h或用2.5μM PP1预培养15 min，并用100 ng/ml EGF在37℃刺激8 min。用甲醇固定细胞，并用抗EGFR（EGFR，以绿色显示）和抗Hrs抗体（Hrs，以红色显示）染色，然后用分别与Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594偶联的二级抗体染色。所有面板显示一个共焦截面。比例尺，20μm。
图7
图7。产生不同的组合酪氨酸磷酸化模式以响应不同的信号输入
(一,b条)HeLa细胞在无血清培养基中饥饿16 h，并用EGF（100 ng/ml）或HGF（250 ng/ml）刺激8 min。(一)用抗Hrs抗体对裂解产物进行免疫沉淀，并用（对-Tyr；顶面板）免疫印迹法评估酪氨酸磷酸化。去除印迹，并用抗Hrs或抗Stam抗体进行复制（底部面板）。(b条)用抗PY334-Hrs或抗PY198-STAM抗体通过免疫印迹法分析裂解液，并像(一). (c（c）,d日)将HER14细胞血清饥饿16小时，并且用EGF（100ng/ml）或PDGF（30ng/ml）不刺激或刺激8分钟。(c（c）)用抗STAM抗体对裂解液进行免疫沉淀，并用对-Tyr进行免疫印迹（顶面板）。用抗Hrs或抗STAM抗体重制印迹（底部面板）。(d日)用抗STAM抗体对裂解液进行免疫沉淀，用抗PY334-Hrs或抗PY198-STAM抗体进行免疫印迹。斑点被剥去并重新处理，如(一).
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