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.2005年4月；25(8):3040-55.
doi:10.1128/MCB.25.8.3040-3055.2005。

缺氧条件下的适应性肌生成

钟云 1, 群林, 阿马托·J·贾西亚
附属公司

缺氧条件下的适应性肌生成

钟云等。 分子细胞生物学. 2005年4月.

摘要

先前的研究表明，成肌细胞可以分化和修复缺血损伤后的肌肉损伤。然而，目前尚不清楚缺血微环境中的缺氧或葡萄糖缺乏是如何影响成肌细胞分化的。我们发现肌肉发生可以适应缺氧条件。这种适应性机制伴随着最初对myoD、E2A和myogenin基因的抑制，然后以氧依赖的方式恢复其表达。低氧对myoD转录的调节与与myoD启动子相关的组蛋白的瞬时脱乙酰化有关。值得注意的是，与前脂肪细胞或成软骨细胞等其他细胞类型的分化不同，缺氧对肌肉发生的影响独立于HIF-1，HIF-1是缺氧条件下普遍存在的转录调节因子。虽然肌生成也可以适应葡萄糖剥夺，但在缺血环境中发现的严重缺氧和葡萄糖剥夺的结合会导致成肌细胞的明显丢失。我们的研究表明，缺血肌肉可以通过肌原性前体的适应性分化进行修复，这取决于缺血微环境中的氧和葡萄糖水平。

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数字

图1。
图1。
缺氧对肌肉生成的影响。（A、B和C）C2C12细胞在不同pO下分化2水平持续3天。细胞固定并用苏木精（A）染色，或用碘化丙啶（红色）免疫荧光法对MHC（绿色）染色作为核染色（B）。C组表示四个随机场中MHC阳性核的平均数。（D） C2C12细胞在21或0.01%氧浓度下分化3天2用台盼蓝染色分析细胞活力。棒材，50μm。
图2。
图2。
肌肉发生对缺氧的适应。（A） C2C12细胞在不同pO下分化2水平1至3天，然后在21%O下分化3天2（B）C2C12细胞在0.5%的氧浓度下分化2连续3、6或12天，在21%O下分化3天2用于比较。苏木精染色（A和B）后分析肌纤维形成。结果代表了至少三个独立实验。棒材，50μm（A）和100μm（B）。
图3。
图3。
细胞能量代谢在肌发生中的作用。（A） C2C12细胞在21%O条件下分化3或6天2每升含4.5克葡萄糖和NaN三（0或100μM）。（B） C2C12细胞在21%O条件下分化3或6天2在每升4.5g葡萄糖和2-脱氧葡萄糖（0或100mM）的存在下或在NaN的存在下三（0或100μM），但不含葡萄糖。（C） C2C12细胞在0.5%的氧浓度下分化3或6天2在含有NaN的无葡萄糖培养基中三（0或100μM）。细胞被固定，并用碘化丙啶（红色）免疫荧光染色MHC（绿色）作为核复染。棒材，100μm（A、B）和50μm（C）。
图4。
图4。
缺氧对肌源性基因表达和mRNA稳定性的影响。（A） C2C12细胞在不同pO下分化2水平1至3天。通过总RNA的Northern印迹分析肌源性基因的时间表达。结果代表至少三个独立实验。（B） C2C12细胞和原代成肌细胞在含有5μg放线菌素D（ActD）/ml的DM中以21%和0.5%的浓度处理指定的时间段（以小时为单位）2分别是。制备总RNA，并按照面板A所述进行Northern印迹。使用NIH图像1.63分析相对带强度。
图5：。
图5：。
低氧对肌D蛋白稳定性和表达的影响。（A，B）C2C12细胞在不同pO下分化2水平1至3天。以β-肌动蛋白为对照，通过全细胞裂解物的Western blotting分析肌D和肌生成素蛋白的时间变化（a）。（B） 在第2天和第4天从分化的C2C12细胞制备细胞质和核裂解物。以β-肌动蛋白作为细胞质对照，TAFII-70作为细胞核对照，通过Western blotting分析myoD的细胞分布。至少有三个独立实验的结果具有代表性。（C） C2C12细胞和原代成肌细胞在含有25μg环己酰亚胺（CHX）/ml的DM中在21和0.5%的氧浓度下处理指定的时间段2分别是。Western blotting分析肌D蛋白水平。通过硝化纤维印迹的Ponceau S染色以及β-肌动蛋白的Western印迹验证蛋白质负载。利用NIH图像1.63分析带强度。结果代表了至少三个独立实验。（D） C2C12细胞在0.5%的氧浓度下在DM中培养指定的时间段（天）2在制备裂解物之前，用10μM MG132处理C2C12细胞6 h。通过Western blotting分析myoD蛋白水平。
图6。
图6。
通过异位MRF表达拯救缺氧抑制肌生成。C2C12细胞感染含有指示基因的逆转录病毒，并在不同pO下分化2水平持续2天。将细胞固定，并用碘化丙啶（红色）对MHC（绿色）进行染色，作为核复染。结果代表了两个独立的实验。棒材，50μm。
图7。
图7。
低氧对肌营养不良和原代成肌细胞中的肌生成素基因。（A） 原代成肌细胞在分化培养基中培养，培养时间为指定的时间段（天），培养温度为21和0.5%O2分别是。表达的变化肌营养不良Northern印迹法检测肌生成素mRNA。Western blotting分析肌D和肌生成素蛋白水平。（B） 原代成肌细胞在不含葡萄糖的DM中培养，培养时间为指定的时间段（天），培养温度分别为21和0.5%2分别是。Western blotting分析肌D和肌生成素蛋白水平。
图8。
图8。
组成型活性HIF-1α突变体对肌生成的影响。（A） C2C12细胞感染含有HIF-1型α构造并允许在不同pO下区分2水平持续2天。细胞被固定，并用免疫荧光染色MHC（绿色）和碘化丙啶（红色）作为核复染。结果代表了三个独立的实验。（B） HIF-1α结构体的相对转录活性以5XHRE-核糖核酸酶为报告物，通过荧光素酶分析进行评估。内源性HIF-1的转录活性反映在载体控制样品中。正常氧，21%O2; 缺氧，0.01%O2（C）C2C12细胞感染含有全长DEC1/Stra13号机组并在21%O下诱导分化3天2.棒材，50μm。
图9：。
图9：。
低氧抑制肌生成中Notch信号通路和HES家族蛋白的评估。（A） 在指定条件下，从分化的C2C12细胞中收集总RNA。用基因特异性引物进行RT-PCR。（B） 在指定的条件下，通过分化C2C12细胞制备全细胞裂解物。用抗Notch1单克隆抗体（克隆mN1A；Becton Dickinson）免疫印迹NICD。（C） C2C12细胞在21%或0.5%的氧浓度下分化3天2在DAPT的存在下阻止缺口激活。用抗MHC免疫荧光（绿色）分析肌纤维形成。
图10。
图10。
缺氧对细胞转录活性的影响肌营养不良发起人。稳定表达所示蛋白的C2C12细胞肌营养不良启动子驱动的荧光素酶报告基因可以在21或0.5%的氧浓度下进行肌源性分化2在指定时间进行荧光素酶分析。（A） 为了更好地反映缺氧对肌营养不良启动子活性，每个肌营养不良启动子结构被标准化为SV40启动子驱动的荧光素酶（pGL2）的缺氧/常压比率。（B） 在所示条件下诱导C2C12细胞分化。在SDS样品缓冲液中制备总细胞裂解物，并对乙酰化H3和H4进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹。Actin充当加载控件。用5 mM丁酸钠（NaBut）处理的细胞作为乙酰化组蛋白的阳性对照，其他通道中负载量的1/5。（C） 在所示条件下诱导C2C12细胞分化。用兔抗乙酰化H3或对照兔IgG进行ChIP分析。这个肌营养不良用巢式引物PCR扩增启动子。利用两个独立的凝胶分析（D）的NIH图像1.63分析带强度。
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