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.2005年2月22日；102(8):2760-5.
doi:10.1073/pnas.0409817102。 Epub 2005年2月8日。

泛素化货物的氯氰菊酯非依赖性内吞作用

萨拉·西吉斯蒙德 1, 坦尼娅·沃尔克, 克劳迪娅·普里, 埃琳娜·马斯佩罗, 卡洛·塔切蒂, 彼得罗·特雷迪科, Paolo Di Fiore码头, 西蒙娜·波罗
附属公司

泛素化货物的氯氰菊酯非依赖性内吞作用

萨拉·西吉斯蒙德等。 美国国家科学院程序. .

摘要

质膜受体可以通过氯菊酯依赖和非氯菊酯途径被内吞。这里，我们表明，当用低剂量EGF刺激时，表皮生长因子受体（EGFR）几乎完全通过网格蛋白途径内化，而不是泛素化。然而，当配体浓度较高时，随着受体变得泛素化，大部分受体通过不依赖于网格蛋白、依赖于脂筏的途径被内吞。泛素化受损的EGFR突变体通过网格蛋白途径内化，而仅能通过其泛素（Ub）部分发出信号的EGFR/泛素嵌合体仅通过非网格蛋白途径内化。泛素化EGFR的非板条蛋白内化依赖于其与包含Ub-相互作用基序的蛋白质的相互作用，如三种Ub-交互作用基序蛋白eps15、eps15R和epsin的消融所示。因此，eps15s和epsin在将泛素化的货物与不依赖于氯氰菊酯的内化偶联方面发挥着重要作用。

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数字

图6。
图6。
多重KD对内化的影响。(A类)(顶部)如图所示，对来自HeLa KD稳定克隆（+）的eps15/eps15R、epsin或eps15/eps15R/epsin（三重KD）的裂解液或来自使用不匹配寡核苷酸（-）获得的对照克隆的裂解液进行免疫印迹。(中间)EGFR水平在所有克隆中都具有可比性。(底部)网格蛋白KDs中网格蛋白的水平。(B类)(上部)用HA-EGFR/Ubmut嵌合体转染所示的HeLa KD克隆（参见支持材料和方法)以避免内源性EGFR的存在。用抗HA抗体评估内化情况。数据表示为内化被抑制的细胞百分比。(下部)表达HA-EGFR/Ubmut的HeLa三重KD克隆被转染了指定的eps15mut结构（参见支持材料和方法). 内化分析和条形图如所示上部这些实验的实际图像如图11所示。(C类)携带指示KD的HeLa克隆用1.5 ng/ml培养125I-EGF。内化率表示为内化/表面结合放射性。*,P（P）= 0.0164;**,P（P）= 0.003; 线性回归分析。(D类)用filipin（+）或模拟处理（-）处理指示的HeLa KD克隆，然后用1.5或20 ng/ml培养125I-EGF在37°C下持续6分钟。内化率表示为内化/表面结合放射性。
图1。
图1。
不同剂量EGF对EGFR的内化作用。(A类)用免疫电子显微镜观察包衣凹坑（CP）、包衣囊泡（CV）、小窝（CAV）或小窝样结构（CVS）中HeLa细胞的EGFRwt。（巴，111纳米）(B类)将HeLa细胞的裂解液（1 mg）进行免疫沉淀（IP）或直接加载（50μg），并用所示抗体进行免疫印迹（IB）。
图2。
图2。
EGFR/Ub的内部化。(A类)表达EGFRwt或EGFR/Ubmut的NR6细胞用罗丹明-EGF（红色）处理（15分钟），并用网格蛋白或小窝蛋白（绿色）染色。(左侧)方框包围放大的区域赖特（放大倍数，×4）。在存在或不存在EGF的情况下，使用13A9抗EGFR抗体进行内化分析时，也获得了类似的结果（数据未显示）。(B类)表达EGFR/Ubmut或EGFR/FLAG的NR6的免疫电子显微镜【无Ub-对照嵌合体（4）】。EGFR/Ubmut仅在小窝中检测到（分析了20个细胞轮廓）。（巴，83纳米）
图4。
图4。
UIM蛋白和EGFR/Ubmut。(A类)如上述凝胶所示，转染φ-NX细胞。如图所示，对裂解液（5 mg）进行免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）。(B类)表达EGFR/Ubmut的NR6的免疫电子显微镜。（Bar，83 nm）箭头指向小窝膜。注意，在表达EGFR/FLAG对照嵌合体的细胞中，小窝中从未检测到eps15和epsin（数据未显示）。(C类)用EGFR/Ubmut和GFP或GFP-UIM（eps15的氨基酸842-897）共同转染CHO细胞，并用罗丹明-EGF（红色，左侧)或罗丹明转铁蛋白（红色，居中). 显示合并的图像。(赖特)EGF内化的定量评估（3 ng/ml125I-EGF在37°C下持续15分钟）。
图3。
图3。
泛化和内化。(A类)表达EGFRwt或Y1045F的CHO细胞裂解物（5 mg）用所示抗体进行免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）。(B类)CHO细胞与所示的GFP标记和各种基于EGFR的构建物共转染，并与罗丹明-EGF孵育。条形图表示EGF内化被抑制的细胞的百分比（标准化为对照GFP转染的细胞）。(C类)用所指示的药物处理表达所指示的构建体的NR6细胞。在高EGF存在的情况下，用抗EGFR13A9抗体监测内化。(D类)表达所示结构的NR6细胞用filipin处理，然后用20 ng/ml孵育125I-EGF在37°C下持续15分钟。内化率表示为内化/表面结合放射性。描述的实验的实际图像B类和C类如图8所示。
图5。
图5。
UIM蛋白与泛素化EGFR结合。(A类)对HeLa细胞的裂解物（5 mg）进行免疫沉淀（IP）和带有指示抗体的免疫印迹（IB）。(B类)CHO细胞瞬时共转染EGFRwt或Y1045F，并分别转染epsin、eps15和肝细胞生长因子受体底物（Hrs）。如图所示，对裂解液（2 mg）进行免疫沉淀/免疫印迹。(C类)用所示的编码野生型eps15或eps15-UIM缺失突变体[eps15Δ859–897（29）]、野生型epsin或epsin-UIM缺失突变体[epsinΔ190–192（29）]FLAG-tagged构建物转染HeLa细胞。FLAG是一个空的控制矢量。如图所示，对裂解液（2 mg）进行免疫沉淀/免疫印迹。
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中的注释

  • 膜受体的内吞作用：两种途径优于一种。
    阿吉拉尔RC，温德兰B。 Aguilar RC等人。 美国国家科学院院刊2005年2月22日；102(8):2679-80. doi:10.1073/pnas.0500213102。Epub 2005年2月14日。 美国国家科学院院刊，2005年。 PMID：15710869 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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