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.2005年2月；25(4):1298-308.
doi:10.1128/MCB.25.4.1298-1308.2005。

猴病毒40小t抗原介导蛋白磷酸酶2A向雄激素受体的构象依赖性转移

杨春松 1, 迈克尔·J·维托, 斯科特·巴斯比, 本杰明·加西亚, 克里斯蒂娜·T·凯斯勒, 丹尼尔·乔埃利, 杰弗里·沙巴诺维茨, 唐纳德·亨特, 凯瑟琳·伦德尔, 大卫·L·布劳提根, 布莱斯·M·帕斯卡尔
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猴病毒40小t抗原介导蛋白磷酸酶2A向雄激素受体的构象依赖性转移

杨春松等。 摩尔细胞生物学. 2005年2月.

摘要

肿瘤抗原猴病毒40小t抗原（ST）和多瘤病毒中、小t抗原通过与蛋白磷酸酶2A（PP2A）的结构A亚单位结合，部分介导细胞转化。肿瘤抗原替换B亚单位抑制PP2A活性并延长磷酸化依赖信号传导。在这里，我们发现ST介导PP2A A/C异二聚体转移到配体激活的雄激素受体（AR）上。ST的转移严格依赖AR的激动剂激活构象，在细胞中加入雄激素后几分钟内发生，并且可以发生在细胞质或细胞核中。ST的结合改变了A亚单位的构象，当PP2A A/C异二聚体与AR结合时，ST迅速从络合物中解离。PP2A被转移到AR的羧基末端半部分，磷酸酶活性被导向氨基末端活化功能区1中的五个磷酸丝氨酸，交易活跃度相应降低。因此，ST作为一种转移因子，在细胞中指定PP2A靶向，并调节AR的转录活性。

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数字

图1。
图1。
PP2A作为AR复合物亚单位的鉴定。（A） 通过免疫亲和纯化分离AR复合物。表达AR的Cos7细胞用10 nM R1881（合成雄激素）或30μM Casodex（Cas）处理1 h。免疫纯化后，用SDS-PAGE和银染色分析复合物，并切除多肽并用质谱分析。盒子中的多肽对应于PP2A的A亚基和C亚基。（B） 使用PP2A A亚基和C亚基抗体对从Cos7细胞获得的AR复合物进行免疫印迹。（C） AR和PP2A之间的激动剂特异性相互作用。用1 nM 5-α-二氢睾酮（DHT）、100 nM ASD、10 nM R1881或10μM氟他胺（Flut）处理表达AR的Cos7细胞1 h，分离AR复合物并通过免疫印迹检测PP2A A和C亚单位的存在。
图2。
图2。
SV40早期区域需要PP2A转移到AR。（A）PP2A迁移到AR发生在SV40转化的Cos7和293T细胞中。将AR转染到所示的细胞类型中，并在加入10nM R1881（1小时）后，分离AR复合物，并通过银染色和免疫印迹进行检测。（B） 用SV40早期区域瞬时转染293细胞可将PP2A转移到雄激素结合的AR上，以及绿色荧光蛋白-RAR，无论是否存在其同源配体地塞米松、雌二醇和所有-反式维甲酸。显示AR、GR、ER和绿色荧光蛋白-RAR的位置（*）。免疫印迹中负载的AR复合物的数量是银染色的一半，而免疫印迹的其他NR的数量与银染色的相同。
图3。
图3。
ST介导PP2A转移到AR上。（A）前列腺癌细胞株中的小t抗原（t）而非大t抗原（t。注意，从对照细胞或雄激素处理细胞分离的AR复合物中未检测到ST或大T抗原（数据未显示）。（B） PP2A转移反应中J域函数的分析。导致J结构域功能丧失的突变并不影响ST介导的PP2A转移到AR上。AR和野生型ST（WT）或指示的ST突变形式在293细胞中表达。雄激素治疗后，分离AR复合物并检测PP2A亚单位的存在。（C） PP2A转移到AR需要与ST进行物理相互作用。ST（C103S）中的突变破坏了与PP2A的结合，从而抑制了转移反应。AR和野生型ST（WT）或C103S突变体在293细胞中表达。（D） 与ST结合的PP2A可以与ST介导的PP2A转移到AR上解偶联。10个氨基酸的Myc标签与C末端的融合产生了与PP2A结合的ST形式（泳道2），但未能介导PP2A转移到AR上（泳道4）。显示ST（*）和ST-Myc（**）的位置。（E） 用纯化成分在体外重建PP2A转移反应。将293细胞中表达的AR固定在小球上，并与纯化的PP2A A/C异二聚体和重组ST进行转移反应。（F）用重组A亚单位重建PP2A转移反应。除使用细菌中表达的His-tagged a亚单位代替PP2A a/C异二聚体外，其余反应均按面板E所述进行。
图4。
图4。
PP2A转移需要AR的DBD-hinge-LBD区域，发生在细胞质和细胞核中。（A） 删除分析，以确定AR可以稳定结合到PP2A的最小区域。AR结构在Cos7细胞中表达为与FLAG表位的N端融合，并使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀和免疫印迹。（B） PP2A在体内快速转移到AR上。表达AR的Cos7细胞用R1881（10 nM）处理指定时间。如果将R1881添加到细胞裂解液中，则PP2A不会转移到AR上，这表明在细胞裂解后没有发生转移反应（未显示）。（C） PP2A可以转移到NLS突变的AR上，该AR主要位于胞浆中。（D） PP2A可以转移到组成性定位于细胞核或细胞质的AR上。AR在Cos7细胞中以SV40的NLS（NLS-AR）和蛋白激酶抑制剂（NES-AR）的NES融合表达。R1881处理后，分离AR复合物并通过免疫印迹检测PP2A A和C亚单位的存在。
图5：。
图5：。
PP2A使AR的AF-1区去磷酸化。（A）与AR结合的PP2A具有催化活性。AR在未经处理或用R1881处理以诱导体内PP2A负载的Cos7细胞中表达。洗脱AR复合物并分析其磷酸酶活性。（B） AR AF-1区五种磷酸丝氨酸的ST依赖性负载和PP2A依赖性去磷酸化。AR在293细胞中表达，无论是否存在ST，细胞要么未经处理，要么用R1881处理（10 nM处理2 h）。用泛AR抗体（PG-21）和一组磷酸特异性AR抗体对样品进行分析。（C） PP2A去磷酸化需要负载到AR293细胞上。表达AR和野生型或Myc-tagged型ST的细胞未经处理或用R1881处理，AR复合物被分离出来并用磷酸特异性抗体进行免疫印迹分析。显示ST（*）和ST-Myc（**）的位置。
图6。
图6。
用R1881处理的对照和ST-转染HEK293细胞AR磷酸肽的质谱分析。（A） 对照样品中显示了含有Ser650或Ser94的两种AR肽的非磷酸化和磷酸化形式的选定离子色谱图。通过计算每个选定离子的所有电荷态曲线下的面积来确定每个肽的丰度。通过将非磷酸化形式和磷酸化形式的离子丰度相加，计算出每种肽的所有形式的总离子丰度。将EVIQNPGPR的选定离子色谱图作为对照，以证明每个样品中没有多种形式的AR肽的水平。（B） 与面板A中的分析相同，只是我们使用了从表达ST的细胞制备的样品。（C）对照组和转染ST的样品之间Ser650和Ser94的磷酸化差异表示为归因于该肽磷酸化形式的每个肽的总离子丰度的百分比。这些数字是通过将每个肽磷酸化形式的离子丰度除以同一样品中该肽所有形式的总离子丰度来计算的。
图7。
图7。
PP2A负载和去磷酸化抑制AR转录活性。（A） SV40早期区域对AR依赖性转录的影响。在SV40早期区域缺失和存在的情况下，使用融合到萤火虫荧光素酶（PSA-LUC）的6-kb PSA启动子在LNCaP细胞中测量雄激素依赖性转录（内源性AR）。细胞在无酚红培养基中培养，培养液中含有木炭色的血清，然后用1 nM R1881进一步处理24 h以诱导转录。检测一式三份，使用巨细胞病毒进行标准化-雷尼利亚荧光素酶和是至少三个实验的代表。（B） SV40早期区域对雌激素受体依赖性转录的影响。使用基于卵黄原蛋白启动子（Vit6-LUC）的萤火虫荧光素酶报告子在LNCaP细胞中测量雌激素（E2）依赖性转录（转染ERα）。（C） ST表达对AR依赖性转录的影响。将编码SV40 ST的质粒的浓度增加（6.25至100 ng/孔）与PSA-LUC共同转染到LNCaP细胞中。对样本进行转录（顶部）和AR表达水平（底部）分析。（D） PP2A对AR介导的转录的负载依赖性和非依赖性影响。在野生型ST和Myc-tagged ST存在的情况下，测量PSA启动子的AR依赖性转录，后者结合PP2A，但不介导PP2A负载到AR。（E）剂量-反应曲线显示ST对AR依赖性表达的影响。通过增强化学发光、X射线胶片扫描密度测定和ImageQuant软件测定ST（闭合圈）和ST与Myc表位融合（开放圈）的相对表达水平。（F） ST表达降低内源性PSA水平。1 nM R1881可诱导LNCaP细胞第1和第2通道PSA的表达；第3和第4道，LNCaP细胞感染对照腺病毒（Ad）或ST-表达腺病毒（Ad-t）24小时，然后用1 nM R1881处理额外24小时。通过免疫印迹分析全细胞裂解液中的PSA水平。
图8。
图8。
ST结合改变PP2A的构象。（A） 图中显示了PP2A的A亚单位中15个HEAT重复序列的排列，HEAT重复3到6上的ST结合位点，以及显示ST结合导致可及性降低（小箭头）或增强（大箭头）的蛋白水解裂解位点。（B） PP2A A亚单位的体外蛋白水解。在无重组ST和有重组ST的情况下，用糜蛋白酶消化纯化的重组A亚单位，并通过SDS-PAGE和银染分析产物。U、 未消化的样品。ST以～20kDa的速度迁移（6至10车道）。（C和D）将消化产物与PP2A A亚基的N和C末端的表位抗体平行检测。（E） 需要将构象依赖性PP2A加载到AR.B亚单位解离（步骤1）上的模型来揭示ST在A亚单位上的结合位点。ST与A/C异二聚体结合（步骤2）诱导A亚单位的构象变化。雄激素与AR结合可诱导构象改变（步骤3），此外，该改变可促进激酶的识别和磷酸化。ST和PP2A A/C的三元络合物与雄激素结合AR对接（步骤4），释放与AR结合的ST.PP2A，使N末端AF-1区域内的五个磷酸丝氨酸脱磷酸化（仅显示两个）。AF-1区的Ser16和铰链区的Ser650没有去磷酸化。
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