Processing of ATG8s, ubiquitin-like proteins, and their deconjugation by ATG4s are essential for plant autophagy

doi:10.1105/tpc.104.025395

.2004年11月；16(11):2967-83.

doi:10.1105/tpc.104.025395。 Epub 2004年10月19日。

ATG8s、泛素样蛋白的加工及其与ATG4s的解偶联对植物自噬至关重要

吉本科吉¹, 花冈秀树, 佐藤舒生, 加藤友彦, 田田聪, 野田毅, Ohsumi吉诺里

附属公司

PMID： 15494556
预防性维修识别码： PMC527192
内政部： 10.1105/tpc.104.025395

ATG8s、泛素样蛋白的加工及其与ATG4s的解偶联对植物自噬至关重要

吉本科吉等。植物细胞. 2004年11月.

.2004年11月；16(11):2967-83.

doi:10.1105/tpc.104.025395。 Epub 2004年10月19日。

作者

吉本科吉¹, 花冈秀树, 佐藤舒生, 加藤友彦, 田田聪, 野田毅, Ohsumi吉诺里

附属

¹日本冈崎市Myodaiji-cho国立基础生物学研究所细胞生物学系，邮编：444-8585。

PMID： 15494556
预防性维修识别码： PMC527192
内政部： 10.1105/tpc.104.025395

摘要

自噬是细胞质成分空泡降解的细胞内过程。迄今为止，植物自噬主要是通过形态学分析进行研究的。最近的一项全基因组搜索揭示了酵母和植物中自噬基因（ATG）的显著保守性。然而，尚未证明拟南芥ATG基因是植物自噬所必需的。为了评估这一需求，我们检测了泛素化样的Atg8脂质体系统，其组成基因均在拟南芥基因组中发现。在拟南芥中，所有9个ATG8基因和2个ATG4基因都普遍表达，并且进一步受到氮饥饿的诱导。为了建立一个监测整个植物自噬的系统，我们构建了表达每个绿色荧光蛋白-ATG8融合物（GFP-ATG8）的转基因拟南芥。在野生型植物中，观察到GFP-ATG8s在细胞质中呈环状，并在保氮条件下被输送至液泡腔。相比之下，在ATG4s的T-DNA插入双突变体（atg4a4b-1）中，未观察到自噬体，并且GFP-ATG8s未在氮气保护条件下输送到液泡。此外，我们在野生型根的液泡中检测到自噬体，但在含有V-ATP酶抑制剂concanamycin A的atg4a4b-1液泡中未检测到自吞噬体。生化分析也证明高等植物的自噬需要ATG蛋白。atg4a4b-1的表型分析表明，植物自噬有助于营养限制条件下根系的发育。

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数字

**图1。**
RT-PCR分析*自动液位计8*和*自动液位计4*拟南芥中的表达。**（A）**和**（C）**从水培4至5周的野生型拟南芥的根（R）、茎（St）、叶（L）、花（F）和角果（Si）中分离出总细胞RNA，并使用基因特异性引物进行RT-PCR。所有反应在35个循环后终止RT-PCR，并对产物进行电泳和检测。**（B）**和**（D）**野生型拟南芥在营养丰富的水培培养基（7 mM硝酸盐）中生长5周，然后转移到缺氮水培培养液（0 mM硝酸酯）中培养1天。在缺氮1、3、6和12小时后，从叶片中分离出总细胞RNA，并进行定量RT-PCR（B）或半定量RT-PCR（D）抄本数量以任意单位表示。在22个周期后终止半定量RT-PCR自动液位计4a和*自动液位计4b*和20个循环*UBQ10（UBQ10）*.对产品进行电泳和检测。泛素基因，*UBQ10（UBQ10）*被用作RNA水平的内部控制。

**图2。**
ATG8在其C末端被ATG4蛋白酶裂解。**（A）**抗ATG8a和抗ATG8 i抗体的交叉反应。酵母蛋白质提取物Δ*第4天*Δ*第8天*除了拟南芥ATG8s-3Xmyc蛋白或酵母Atg8-3Xmyc外，还表达拟南芥子ATG4a的突变细胞分别使用抗ATG8a（顶面板）和抗Atg8 i抗体（中间面板）通过免疫印迹法进行分析。抗ATG8i抗体检测到的非特异性条带显示在底部面板中，作为加载到泳道中的等量蛋白质的对照。**（B）**切割试验的代表性数据。酵母蛋白质提取物Δ*第4天*Δ*第8天*分别使用抗myc抗体（左）或抗ATG8a抗体（右）通过免疫印迹分析表达拟南芥ATG8a-3Xmyc蛋白（第1和第4道）的突变细胞，或表达拟南质ATG4a和拟南质ATM8a-3Xmyc蛋白的突变细胞（第2和第5道）。仅从酵母中提取的蛋白质Δ*第4天*Δ*第8天*突变细胞作为阴性对照（第3和第6道）。**（C）**所有ATG8的裂解分析。酵母蛋白质提取物Δ*第4天*Δ*第8天*表达拟南芥ATG8s-3Xmyc蛋白或酵母Atg8-3Xmyc（顶面板）的突变细胞，或表达拟南质ATG4a和拟南质ATM8s-3Xmyc蛋白的突变细胞或表达酵母Atg8-3Xmyc（底面板）的突变体细胞，使用抗myc抗体（顶面板上）或抗ATG8a和抗Atg8 i抗体（底面板上）进行免疫印迹分析，分别是。

**图3。**
ATG8与膜的关联。**（A）**ATG8s的亚细胞分布。从4周龄野生型叶片制备的总裂解物（T）在13000℃下离心克持续15分钟以生成上清液和颗粒（LSP）。然后将产生的上清液在100000下离心克持续1小时以生成更多上清液（HSS）和颗粒（HSP）。用纯化的抗ATG8a抗体对这些样品进行免疫印迹分析。**（B）**在LSP（顶部面板）和HSP（底部面板）中恢复的ATG8的溶解。野生型叶片的LSP和HSP在含有盐、尿素、碳酸钠（Na₂一氧化碳_三)、Triton®声波风廓线仪X-100（TX-100）或DOC。再次离心样品，用纯化的抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析产生的上清液（S）和颗粒（P）。**（C）**颗粒部分是假定的改良形式。来自4周龄野生型叶片的细胞组分（LSP、HSP和HSS）用6 M尿素进行SDS-PAGE，用纯化的抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析。

**图4。**
ATG8蛋白在不同器官发育阶段的表达。从根（R）、茎（St）、叶（L）、花（F）和西力克（Si）制备的总蛋白质样品**（A）**或从生长1至6周的一系列野生植物中制备的总蛋白样品**（B）**在不使用（顶面板）或使用（中面板）6 M尿素的情况下进行SDS-PAGE，并使用纯化的抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析。将20微克的总蛋白质应用于每个柱。星号表示ATG8的未修改形式，箭头表示假定的PE共轭形式。底部面板显示了经考马斯亮蓝染色的点刻聚偏二氟乙烯膜和SDS-PAGE，作为装载到通道中的等量蛋白质的对照。

**图5。**
GFP-ATG8融合蛋白在拟南芥悬浮培养原生质体中的定位。**（A）**到**（K）**MS中生长的表达GFP-ATG8a、8e和8i的拟南芥细胞(**[答]**,**【D】**,**【G】**、和**[日本]**)和MS-N(**【B】**,**[英]**、和**【H】**)中等。Nomarski图像**（B）**,**（E）**,**（H）**、和**（J）**如所示**（C）**,**（F）**,**（一）**、和**（K）**分别是。**（左）**到**（吨）**在MS中生长的拟南芥细胞表达GFP-ATG8a-A、8e-A和8i-A，其C端含有Gly-to-Ala替代物(**【L】**,**【O】**、和**【右】**)和MS-N(**[男]**,**【P】**、和**【S】**)中等。Nomarski图像**（百万）**,**（P）**、和**（S）**如所示**（N）**,**（问）**、和**（吨）**分别是。**（U）**和**（五）**仅表达GFP的拟南芥细胞作为对照**（U）**Nomarski图像**（U）**如所示**（五）**星号表示淀粉颗粒。所有刻度与中的相同**（五）**; bar=10μm。插入**（A）**,**（D）**,**（G）**,**（左）**,**（O）**、和**（右）**分别在高倍率下显示环形和点状结构（条形=1.25μm）。

**图6。**
描述*atg4a-1*,*atg4b-1*、和*atg4a4b-1*突变体。**（A）**两个ATG4基因中T-DNA插入位点的示意图。线表示内含子，框表示外显子（开盒，非翻译区；闭盒，翻译区）。**（B）**RT-PCR分析*自动液位计4*野生型和T-DNA插入突变体中的基因。从野生型、，*atg4a-1*,*atg4b-1*、和*atg4a4b-1*并进行RT-PCR。使用基因特异性引物进行35个周期的RT-PCR，以扩增全长ORF。**（C）**ATG8s在中的表达*自动变速箱*破坏突变体。6周龄野生型的总蛋白质样本，*atg4a4b-1*,*atg4a-1*,*atg4b-1*、和*第9-1天*叶片在没有（顶面板）和（中面板）6M尿素的情况下进行SDS-PAGE，并用纯化的抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析。将40微克总蛋白涂敷在每根柱上。底部面板显示了考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE，作为装载到通道中的等量蛋白质的对照。**（D）**ATG8蛋白的亚细胞分布*自动变速箱*破坏突变体。4周龄制备的总裂解物（T）*atg4a-1*,*atg4b-1*,*atg4a4b-1*、和*第9-1天*叶片在13000下离心克持续15分钟以生成上清液和颗粒（LSP）。然后将产生的上清液在100000下离心克持续1小时以生成更多上清液（HSS）和颗粒（HSP）。用纯化的抗ATG8a抗体对这些样品进行免疫印迹分析。**（E）**假定的ATG8-ATG3共轭物。野生型和*atg4a4b-1*用纯化的抗ATG8a抗体对有DTT和无DTT的叶片进行免疫印迹分析。箭头表示假定的ATG8-ATG3共轭。

**图7。**
的影响*atg4a4b-1*稳定转化拟南芥根中GFP-ATG8融合蛋白的行为突变。**（A）**到**（F）**稳定表达GFP-ATG8a的野生拟南芥根(**[答]**和**【B】**)，第8页(**[中]**和**【D】**)、和8i(**[英]**和**【F】**).（G）到**（左）** *atg4a4b-1*稳定表达GFP-ATG8a的突变体根(**【G】**和**【H】**)，第8页(**[I]**和**[日本]**)、和8i(**【K】**和**【L】**).（百万）和**（N）**野生型拟南芥根稳定表达GFP作为对照。利用共焦激光扫描显微镜观察MS培养基上生长一周的转基因幼苗的根系(**[答]**,**[中]**,**[英]**,**【G】**,**[I]**,**【K】**、和**[男]**). 对于氮饥饿，将生长在MS培养基上的幼苗转移到MS-N培养基中再培养7天，然后观察(**【B】**,**【D】**,**【F】**,**【H】**,**[日本]**,**【L】**、和**【否】**). 棒材=20μm。插入**（A）**,**（C）**,**（E）**,**（G）**,**（一）**、和**（K）**在高倍镜下分别显示圆环和圆点结构（bar=1μm）。**（O）**GFP-ATG8a的推测PE结合形式。野生型和*atg4a4b-1*表达GFP-ATG8a融合蛋白的人用6%尿素进行8%（w/v）SDS-PAGE，并用抗GFP抗体（Molecular Probes，Eugene，OR）进行免疫印迹分析。箭头表示GFP-ATG8a的假定PE结合形式。星号表示与GFP-ATG8a无关的交叉反应带。**（P）**GFP-ATG8a在*atg4a4b-1*突变体。亚细胞分离按方法中所述进行。来自*atg4a4b-1*表达GFP-ATG8a的突变体在含有盐、尿素、碳酸钠（Na₂一氧化碳_三)、Triton®声波风廓线仪X-100（TX-100）或DOC。再次离心样品，用抗GFP抗体（分子探针）进行免疫印迹分析产生的上清液（S）和颗粒（P）。

**图8。**
野生型和*atg4a4b-1*在含氮条件下用刀豆霉素A处理的突变体。**（A）**到**（C）**野生型根。**（D）**到**（F）** *atg4a4b-1*突变根。**（G）**和**（H）**补充*atg4a4b-1*突变体(*atg4a4b-1；tATG4a公司*)根。1周龄野生型的根(**[答]**到**[中]**),*atg4a4b-1*(**【D】**到**【F】**)、和*atg4a4b-1*用转换*自动液位计4a*基因(**【G】**和**【H】**)在MS培养基上生长的幼苗在含有康那霉素A的MS-N液体培养基中培养12 h，然后用常规透射光显微镜观察。棒材=20μm（A）,**（B）**、和**（E）**到**（H）**和10μm（C）和**（D）**.

**图9。**
Concanamycin A处理后，许多囊泡中积聚的囊泡被GFP-ATG8蛋白染色。**（A）**和**（C）**野生型根的荧光显微照片**（A）**和*atg4a4b-1* **（C）**表达GFP-ATG8a的幼苗。**（B）**和**（D）**Nomarski图像**（A）**和**（C）**分别是。将表达GFP-ATG8蛋白的转基因幼苗的根用康那霉素A（1μM）处理6至12 h，并用光镜和荧光显微镜进行观察。代表性图片如图所示。条形=20μm。插入**（A）**显示了球形结构的放大（bar=5μm）。

**图10。**
植物自噬体的电子显微照片。**（A）**到**（D）**康乃霉素A处理野生型根的电子显微照片。**（E）**和**（F）**电子显微照片*atg4a4b-1*用康奈霉素A处理突变体根。1周龄野生型根(**[答]**到**【D】**)和*atg4a4b-1*(**[英]**和**【F】**)在保氮条件下，用康奈霉素A（1μM）处理幼苗6h。比较根尖相同区域。棒材=10μm（A）和**（E）**，500 nm（C）和**（D）**和1μm（B）和**（F）**.

**图11。**
的表型*atg4a4b-1*缺氮条件下自噬缺陷引起的突变。**（A）**野生型根（左）和*atg4a4b-1*（右）植物在无氮培养基上生长21天。**（B）**初生根长度、整个根系长度、每根初生根的侧根数（LR）以及每根初生根长度的侧根总长度的统计评估。野生型和*atg4a4b-1*将植株播种在无氮培养基上，21天后，利用NIH图像计算初生根长度、侧根数量和侧根总长度。误差条表示标准偏差。所有测量均在至少10个单独的植物上进行。

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1. Altschul，S.F.、Madden，T.L.、Schäffer，A.A.、Zhang，J.、Zhang，Z.、Miller，W.和Lipman，D.J.（1997）。缺口BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序。核酸研究25，3389–3402。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Aubert，S.、Gout，E.、Bligny，R.、Marty-Mazars，D.、Barrieu，F.、Alabouvette，J.、Marty，F.和Douce，R.（1996）。受碳剥夺影响的高等植物细胞自噬的超微结构和生化特征：通过线粒体与呼吸底物的供应进行控制。细胞生物学杂志。133, 1251–1263.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Barth，H.、Meiling-Wesse，K.、Epple，U.D.和Thumm，M.（2001）。自噬和细胞质到液泡靶向途径都需要Aut10p。FEBS信函。508, 23–28.-公共医学
1. Bloom，A.J.、Chapin，F.S.和Mooney，H.A.（1985年）。植物资源限制——经济类比。每年。经济评论。系统。16, 363–392.
1. Burke，D.、Dawson，D.和Stearns，T.（2000年）。酵母遗传学方法：附录A，P.Barker和M.Mazzullo，eds（纽约：CSHI出版社），第171-181页。

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[1] Altschul，S.F.、Madden，T.L.、Schäffer，A.A.、Zhang，J.、Zhang，Z.、Miller，W.和Lipman，D.J.（1997）。缺口BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序。核酸研究25，3389–3402。-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Altschul，S.F.、Madden，T.L.、Schäffer，A.A.、Zhang，J.、Zhang，Z.、Miller，W.和Lipman，D.J.（1997）。缺口BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序。核酸研究25，3389–3402。-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Aubert，S.、Gout，E.、Bligny，R.、Marty-Mazars，D.、Barrieu，F.、Alabouvette，J.、Marty，F.和Douce，R.（1996）。受碳剥夺影响的高等植物细胞自噬的超微结构和生化特征：通过线粒体与呼吸底物的供应进行控制。细胞生物学杂志。133, 1251–1263.-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Aubert，S.、Gout，E.、Bligny，R.、Marty-Mazars，D.、Barrieu，F.、Alabouvette，J.、Marty，F.和Douce，R.（1996）。受碳剥夺影响的高等植物细胞自噬的超微结构和生化特征：通过线粒体与呼吸底物的供应进行控制。细胞生物学杂志。133, 1251–1263.-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Barth，H.、Meiling-Wesse，K.、Epple，U.D.和Thumm，M.（2001）。自噬和细胞质到液泡靶向途径都需要Aut10p。FEBS信函。508, 23–28.-公共医学

[6] Barth，H.、Meiling-Wesse，K.、Epple，U.D.和Thumm，M.（2001）。自噬和细胞质到液泡靶向途径都需要Aut10p。FEBS信函。508, 23–28.-公共医学

[7] Bloom，A.J.、Chapin，F.S.和Mooney，H.A.（1985年）。植物资源限制——经济类比。每年。经济评论。系统。16, 363–392.

[8] Bloom，A.J.、Chapin，F.S.和Mooney，H.A.（1985年）。植物资源限制——经济类比。每年。经济评论。系统。16, 363–392.

[9] Burke，D.、Dawson，D.和Stearns，T.（2000年）。酵母遗传学方法：附录A，P.Barker和M.Mazzullo，eds（纽约：CSHI出版社），第171-181页。

[10] Burke，D.、Dawson，D.和Stearns，T.（2000年）。酵母遗传学方法：附录A，P.Barker和M.Mazzullo，eds（纽约：CSHI出版社），第171-181页。

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ATG8s、泛素样蛋白的加工及其与ATG4s的解偶联对植物自噬至关重要

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