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.2004年10月11日；167(1):27-33.
doi:10.1083/jcb.200408003。

交替开放阅读框架下的翻译再启动在整合应激反应中调节基因表达

菲比·D·路 1, 希瑟·P·哈丁, 大卫·罗恩
附属公司

交替开放阅读框架下的翻译再启动在整合应激反应中调节基因表达

菲比·D·路等。 J细胞生物学. .

摘要

应激诱导的真核生物翻译起始因子2（eIF2）α磷酸化反常地增加后生动物激活转录因子4（ATF4）的翻译，激活整合应激反应（ISR），这是一种促生存基因表达程序。先前的研究表明ATF4 mRNA的5'端及其两个保守的上游ORF（uORF）参与了这一翻译调控。在这里，我们报告了ATF4 mRNA的突变分析，结果表明扫描核糖体在uORF和翻译uORF1的核糖体都能有效启动下游AUG的翻译。在非应激细胞中，低水平的eIF2α磷酸化有助于此类再活化核糖体的早期获能，将其导向抑制性uORF2，从而阻止ATF4的后续翻译并抑制ISR。在应激细胞中，高水平的eIF2α磷酸化延迟核糖体获能，并有利于ATF4的再启动，而不是抑制性uORF2。这些特征在酵母中GCN4的调节翻译中很常见。因此，后生动物ISR在其靶基因和机制细节上都类似于酵母的一般控制反应。

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数字

图1。
图1。
EIF2α磷酸化足以上调ATF4翻译。（A） 表达野生型Fv2E-PERK的短标记脉冲后放射性标记蛋白的SDS-PAGE自射线照片(环境影响因素2A 不锈钢)或突变体(环境影响因素2A A/A公司)用指定浓度的AP20187活化配体预处理30′的小鼠成纤维细胞。面板（从上到下）显示免疫沉淀放射性标记的内源性ATF4、所有放射性标记的新合成蛋白质以及磷酸化和总eIF2α的免疫印迹。（B） 通过激活配体诱导的Fv2E-PERK eIF2α激酶诱导eIF2 a磷酸化后，从未经处理的小鼠成纤维细胞和相同细胞中分离的mRNA的多糖体谱。注意处理细胞中核糖体亚单位和单体的积累。（C） 从B所示梯度收集的组分中对ATF4和GAPDH mRNA进行Northern blot分析。注意，处理细胞中ATF4 mRNA峰值向右移动（较重），GAPDH峰值向相反方向移动。
图2。
图2。
ATF4 mRNA的5′端介导该基因的翻译调控。（A） 小鼠ATF4 mRNA 5′端、衍生物5′ATF4-GFP报告子和亲代GFP报告基因的组织。（B） 用指示的报告质粒转染的野生型CHO细胞或稳定过表达GADD34 COOH末端（阻断eIF2α磷酸化）的细胞的短暂标记脉冲后放射性标记蛋白的SDS-PAGE的放射自显影图。用内质网应激诱导剂thapsigargin（TG）处理细胞指定时间，用特异性抗体免疫沉淀编码的GFP融合蛋白（顶部）和内源性ATF4（底部）。（C） 用ATF4-GFP报告子转染CHO细胞，并用指示浓度的亚砷酸盐（ARS）、亲电甲基甲磺酸甲酯（MMS）、组氨酸（HIS，激活GCN2）、thapsigargin（TG）、，用特异性抗血清免疫沉淀编码GFP融合蛋白（top），即NPTII，由同一质粒上不同基因编码（第二组）和内源性ATF4（第三组）。GFP/NPTII比率提供了对报告者在处理细胞中的翻译诱导能力的估计。磷酸化（eIF2α-P）的免疫印迹和平行裂解物的总eIF2β显示在底部面板中。（D） 表达Fv2E-PERK的CHO细胞经指示浓度的活化AP20187配体处理30′后，在20′标记脉冲之前和期间的放射性标记蛋白的自射线图。用ATF4报告子（5′ATF4-GFP）、蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入位点报告子（IGR IRE5-YFP）或小鼠CD36基因5′端GFP翻译报告子（mCD36-GFP）转染细胞。GFP、内源性ATF4和NPTII在C中用特异性抗血清免疫沉淀。
图3。
图3。
ATF4 mRNA翻译需要核糖体扫描。（A） 预测报告基因表达的mRNA结构。描述了在mRNA的5′端引入的干环，用自动变速箱4导出的终止序列（白色矩形）。（B） 表达Fv2E-PERK的未经处理和AP20187处理CHO细胞的放射性标记蛋白的SDS-PAGE自射线照片。用ATF4-GFP报告子转染细胞，在mRNA的5′端具有或不具有稳定的干环结构。用特异性抗血清免疫沉淀放射性标记的GFP、NPTII和内源性ATF4。如图所示，来自未经处理的转染细胞平行样品的细胞质RNA通过Northern blot进行解析，并与GFP和GAPDH探针杂交。提供了每条车道中标记的GFP与RNA信号的比率。（C） 与B中一样，用具有病毒3′终止序列的ATF4.GFP报告基因（5′ATF4.GFP）或基因组转染细胞自动变速箱43′端终止序列（5′3′ATF4.GFP）或亲代GFP报告子。
图4。
图4。
两个ATF4 uORF都是在基本条件下翻译的。（A） 在这些实验中使用的报告基因表达的mRNA的预测结构。（B） 未经处理和AP20187处理的Fv2E-PERK放射性标记蛋白的SDS-PAGE自射线照片(+)用ATF4-GFP报告子转染CHO细胞，或将uORF1或uORF2融合到GFP的报告子。来自未经处理的转染细胞平行样本的细胞质RNA通过Northern blot进行解析，并与GFP和GAPDH探针杂交。用uORF1-GFP转染的细胞中NPTII的低基础表达是一个无法解释的重复发现。
图5。
图5。
抑制性和刺激性uORF的相互作用调节ATF4的翻译。（A） 这些实验中使用的报告基因表达的mRNA。如有说明，uORF的起始AUG密码子转换为AUA，共线uORF1和uORF2之间的终止密码子分别转换为UCG和UAC。（B） 来自未处理和AP20187处理的Fv2E PERK的放射性标记蛋白的SDS-PAGE放射自显影图(+)用5′ATF4-GFP报告子转染CHO细胞，或uORF1、uORF2或两个uORF的起始密码子突变的报告子，或亲代GFP报告者。如图所示，来自未经处理的转染细胞平行样品的细胞质RNA通过Northern blot进行解析，并与GFP和GAPDH探针杂交。（C） 与B组一样，除了细胞外，其他细胞都转染了报告基因，其中两个uORF之间的终止密码子被转换为Ser或Tyr密码子。
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