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.2004年9月27日；166(7):1027-39.
doi:10.1083/jcb.200407046。

内皮素B1是维持线粒体形态所必需的

马吕斯·卡博夫斯基 1, Seon Yong Jeong先生, 理查德·J·尤尔
附属公司

维持线粒体形态需要内皮素B1

马吕斯·卡博夫斯基等。 J细胞生物学. .

摘要

我们报道了一种脂肪酰基转移酶，即嗜内素B1，是维持线粒体形态所必需的。该蛋白的下调或缺乏NH（2）末端脂质修饰结构域的内白素B1的过度表达导致线粒体分布和形态发生显著变化。在内白素B1敲除细胞和截短蛋白过表达后，还观察到线粒体外膜室与基质分离，线粒体外膜形成小泡和小管，表明内白素B1是调节线粒体外膜动力学所必需的。我们还表明，亲脂酶B1在线粒体网络的同步重塑过程中易位到线粒体，这种同步重塑已被描述为在细胞凋亡过程中发生。内啡肽B1和Drp1的双重敲除导致与Drp1单一敲除相同的线粒体表型，这一结果与Drp 1作用于内啡肽B_1上游维持线粒体形态动力学的结果一致。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
内源性B1 RNAi对线粒体形态的影响。（A） 用endoB RNAi载体转染后内白素B1水平的降低。通过蛋白质印迹分析用GFP-和亲脂酶B1沉默载体转染6天后收获的对照、潮霉素抗性GFP RNAi或endoB RNAi HeLa细胞的亲脂酶B1。肌动蛋白被用作加载控制。（B） GFP RNAi（a）和endoB RNAi。根据线粒体网络的形态，细胞被分为五组（见正文）。显示了四种类型的代表性图像。（C） GFP RNAi的百分比(n个=531）和endoB RNAi(n个=417）对五类细胞进行评分。（D） 未转染HeLa（a）、GFP RNAi（b）和endoB RNAi细胞中的线粒体网络表现示例。注意内切B RNAi细胞中线粒体的高直径变异性和异常分支模式。（E） 通过内白素B1的RNAi不敏感突变重建endoB RNAi细胞的线粒体表型。EndoB RNAi细胞转染了一种内白素B1变体，该变体在RNAi构建物靶向区域内含有五个沉默核苷酸替换。细胞用Mitotracker标记（红色），用抗内啡肽B1单克隆抗体染色（绿色）。（F） 过度表达endoB细胞线粒体的表型记录构造（E，箭头）得分(n个= 680).
图1。
图1。
内源性B1 RNAi对线粒体形态的影响。（A） 用endoB RNAi载体转染后内白素B1水平的降低。通过Western blotting分析转染GFP-和内白素B1沉默载体后6天收获的对照组、耐潮霉素的GFP-RNAi或endoB-RNAi-HeLa细胞的内白素B_1。肌动蛋白被用作加载控制。（B） GFP RNAi（a）和endoB RNAi。根据线粒体网络的形态，细胞被分为五组（见正文）。显示了四种类型的代表性图像。（C） GFP RNAi的百分比(n个=531）和endoB RNAi(n个=417）对五类细胞进行评分。（D） 未转染HeLa（a）、GFP RNAi（b）和endoB RNAi细胞中的线粒体网络表现示例。注意内切B RNAi细胞中线粒体的高直径变异性和异常分支模式。（E） 通过内白素B1的RNAi不敏感突变重建endoB RNAi细胞的线粒体表型。EndoB RNAi细胞转染了一种内白素B1变体，该变体在RNAi构建物靶向区域内含有五个沉默核苷酸替换。用Mitotracker（红色）标记细胞，并用抗内皮素B1单克隆抗体（绿色）染色。（F） 过度表达endoB细胞线粒体的表型记录构造（E，箭头）得分(n个= 680).
图2。
图2。
线粒体融合率不受亲内蛋白B1敲除的影响。使用基于mito-PAGFP的线粒体融合分析测定线粒体融合率。（A） GFP RNAi细胞（A）和endoB RNAi电池（b）通过丝裂原-PAGFP转染，并按照材料和方法中所述进行线粒体融合检测。使用伪彩色图像。（B） 随着时间的推移，测量了GFP RNAi（a）和endoB RNAi中光激活线粒体的荧光强度的变化。
图3。
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除线粒体外，EndoB RNAi不影响膜结合细胞器的形态。共聚焦显微镜分析GFP RNAi（A）和endoB RNAi细胞（B）中ER（Aa和Ba）、高尔基复合体（Ab和Bb）、早期内体（Ac和Bc）、再循环内体（Ad和Bd）、溶酶体（Ae和Be）和过氧化物酶体（Af和Bf）的形态。显示了具有代表性的图像。
图4。
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内白素B1缺失细胞中OMM和IMM室的分离。用Mitotracker（A，A’-f’；和B，A’-t’）标记GFP RNAi（A和C）和endoB RNAic（c）单克隆抗体（A，A–f；和B，A–t）或转染YFP-Fis1（C，A–f；和D，A–j）以显示OMM室。显示了具有代表性的图像。请注意GFP RNAi细胞中基质和OMM隔间的完全共定位，以及内切B RNAi电池中孤立OMM隔室的形成（示例如箭头所示）。在一些情况下，收缩的基质室（箭头）沿着OMM的细管定位并通过其连接。（E） 使用pREP4-Drp1 RNAi系统去除HeLa细胞中的Drp1（参见材料和方法）。通过Western blot分析对照HeLa细胞或转染GFP RNAi或Drp1 RNAi的细胞（用潮霉素筛选4 d）的Drp1水平。肌动蛋白被用作加载控制。（F） Drp1 RNAi细胞用Mitotracker和抗细胞色素染色c（c）单克隆抗体并通过共焦显微镜进行分析。注意线粒体的高度连接性以及IMM和OMM包膜隔室的完全共定位。
图4。
图4。
内白素B1缺失细胞中OMM和IMM室的分离。用Mitotracker（A，A’-f’；和B，A’-t’）标记GFP RNAi（A和C）和endoB RNAic（c）单克隆抗体（A，A–f；和B，A–t）或转染YFP-Fis1（C，A–f；和D，A–j）以显示OMM室。显示了具有代表性的图像。请注意GFP RNAi细胞中基质和OMM隔间的完全共定位，以及内切B RNAi电池中孤立OMM隔室的形成（示例如箭头所示）。在一些情况下，收缩的基质室（箭头）沿着OMM的细管定位并通过其连接。（E） 使用pREP4-Drp1 RNAi系统耗尽HeLa细胞中的Drp1（参见材料和方法）。通过Western blot分析对照HeLa细胞或转染GFP RNAi或Drp1 RNAi的细胞（用潮霉素筛选4 d）的Drp1水平。肌动蛋白被用作加载控制。（F） Drp1 RNAi细胞用Mitotracker和抗细胞色素染色c（c）单克隆抗体并通过共焦显微镜进行分析。注意线粒体的高度连接性以及IMM和OMM包膜隔室的完全共定位。
图4。
图4。
内白素B1缺失细胞中OMM和IMM室的分离。用Mitotracker（A，A’-f’；和B，A’-t’）标记GFP RNAi（A和C）和endoB RNAic（c）单克隆抗体（A，A–f；和B，A–t）或转染YFP-Fis1（C，A–f；和D，A–j）以显示OMM室。显示了具有代表性的图像。请注意GFP RNAi细胞中基质和OMM隔间的完全共定位，以及内切B RNAi电池中孤立OMM隔室的形成（示例如箭头所示）。在一些情况下，收缩的基质隔室（箭头）沿着OMM的细管定位，并由其连接。（E） 使用pREP4-Drp1 RNAi系统去除HeLa细胞中的Drp1（参见材料和方法）。通过Western blot分析对照HeLa细胞或转染GFP RNAi或Drp1 RNAi的细胞（用潮霉素筛选4 d）的Drp1水平。肌动蛋白被用作加载控制。（F） Drp1 RNAi细胞用Mitotracker和抗细胞色素染色c（c）单克隆抗体并通过共焦显微镜进行分析。注意线粒体的高度连接性以及IMM和OMM包膜隔室的完全共定位。
图5。
图5。
NH过度表达2-末端截短的亲内蛋白B1导致线粒体形态缺陷。用endoB转染HeLa细胞60-362ΔN-YFP（A）和带endoB1-59ΔC-YFP（B）和共焦显微镜分析。（C） 在endoB内对线粒体表型进行评分60-362ΔN-YFP–和endoB1-59ΔC-YFP–表达细胞(n个= 400). （D） 在endoB中检测OMM/IMM同步性60-362ΔN-YFP–表达细胞。用Mitotracker（红色）标记细胞，用抗细胞色素染色c（c）单克隆抗体（绿色），并通过共焦显微镜进行分析。注意OMM室与基质的明显分离。
图6。
图6。
内白素B1与线粒体的动态关联。用endoB YFP（A，绿色）转染HeLa细胞，或用抗内亲蛋白B1单克隆抗体（B，绿色）染色，用Mitotracker标记以显示线粒体（A的和中的，二的可的一时，的一。（C） 用差速离心法分离细胞，获得富含线粒体的重膜部分（HM）、轻膜部分（LM）和高速上清液中的可溶性细胞溶质蛋白（HSS），并进行SDS-PAGE和Western blot分析，以揭示嗜内素B1的亚细胞分布。用抗-Bax单克隆抗体作为细胞溶质的标记物，用抗-VDAC单克隆抗体标记线粒体。用1μM STS处理转染pcDNA3-Bax和endoB-YFP的Cos7细胞，并用延时共聚焦显微镜分析内啡肽B1的亚细胞分布。注意在细胞凋亡分解（c–e）之前检测到的endoB-YFP聚集。为了分析endoB-YFP斑块与线粒体的空间关系，用endoB-YFP（E和F，绿色）转染细胞或用抗内啡肽B1单克隆抗体（G，绿色）染色以显示内啡肽B_1的亚细胞分布，并用Mitotracker（F和G，红色）标记或用mito-DsRED2（E，红色）转染以显示线粒体，随后用胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk和STS处理90分钟（E）或用zVAD-fmk和ActD处理36小时（F和G），并通过共聚焦显微镜检查。注意endoB-YFP补丁的线粒体定位。
图6。
图6。
亲脂酶B1与线粒体的动态关联。用endoB-YFP（A，绿色）转染HeLa细胞或用抗内啡肽B1单克隆抗体（B，绿色）染色，用Mitotracker标记以显示线粒体（A和B，红色），并用共焦显微镜进行分析。（C） 用差速离心法分离细胞，获得富含线粒体的重膜部分（HM）、轻膜部分（LM）和高速上清液中的可溶性细胞溶质蛋白（HSS），并进行SDS-PAGE和Western blot分析，以揭示嗜内素B1的亚细胞分布。用抗-Bax单克隆抗体作为细胞溶质的标记物，用抗-VDAC单克隆抗体标记线粒体。用1μM STS处理转染pcDNA3-Bax和endoB-YFP的Cos7细胞，并用延时共聚焦显微镜分析内啡肽B1的亚细胞分布。注意在细胞凋亡分解（c–e）之前检测到的endoB-YFP聚集。为了分析endoB-YFP斑块与线粒体的空间关系，用endoB-YFP（E和F，绿色）转染细胞或用抗内啡肽B1单克隆抗体（G，绿色）染色以显示内啡肽B_1的亚细胞分布，并用Mitotracker（F和G，红色）标记或用mito-DsRED2（E，红色）转染以显示线粒体，然后用caspase抑制剂zVAD-fmk和STS治疗90分钟（E），或用zVAD-fmk和ActD治疗36小时（F和G），并用共焦显微镜检查。注意endoB-YFP补丁的线粒体定位。
图7。
图7。
内白素B1和Drp1同时下调的表型后果。分别或联合使用endoB RNAi和Drp1 RNAi构建物转染HeLa细胞。用潮霉素筛选细胞4天，用Western blot（A）分析蛋白质水平，然后用Mitotracker（B和d，A’-e’）和抗细胞色素染色c（c）用共焦显微镜分析单克隆抗体（D，a–e）。（C） 对Drp1 RNAi和endoB/Drp1 RNA Ai细胞线粒体的表型进行评分(n个= 400). （E） EndoB RNAi细胞转染了一个DN突变体Drp1，Drp1K38A公司（箭头），用Mitotracker标记（红色），用抗Drp1单克隆抗体染色（绿色），并用共焦显微镜进行分析。在endoB/Drp1双RNAi细胞中，内亲素B1单RNAi表型的完全逆转和Drp1-like单RNAi-表型细胞的形成表明，Drp1可能是导致线粒体分裂的事件链中内亲素A1的上游因子。
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