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.2004年10月；24(19):8504-18.
doi:10.1128/MCB.24.19.8504-8518.2004。

低氧癌细胞中Rad51的下调和同源重组的减少

兰吉特·宾德拉 1, 保罗·夏弗, 艾丽斯·孟, 詹妮弗·吴, 库尔斯坦马赛德, 马特·罗斯, 保罗·利扎迪, 大卫·W·赫德利, 罗伯特·布里斯托, 彼得·M·格雷泽
附属公司

低氧癌细胞中Rad51的下调和同源重组的减少

兰吉特·宾德拉等。 分子细胞生物学. 2004年10月.

摘要

有一个新出现的概念是，癌细胞获得性遗传不稳定性可能是由于炎症和缺氧等细胞应激导致关键DNA修复途径的失调。在这里，我们报道了缺氧特异性下调RAD51的表达，RAD51是哺乳动物细胞中同源重组的关键介质。低氧暴露期间，在多种癌症细胞类型中观察到Rad51水平降低，且与细胞周期特征或低氧诱导因子的表达无关。对RAD51基因启动子活性以及mRNA和蛋白质稳定性的分析表明，该基因的低氧介导调控是通过转录抑制实现的。此外，在缺氧后细胞中观察到Rad51的表达降低，并在复氧后持续48小时。相应地，我们发现低氧和缺氧后细胞中同源重组水平降低，表明低氧相关的Rad51表达减少对DNA修复具有功能性后果。此外，通过对小鼠实验性肿瘤的免疫荧光图像分析，在体内证实了低氧介导的Rad51下调。基于这些发现，我们提出了一种新的肿瘤微环境遗传不稳定性机制，该机制通过低氧诱导抑制癌细胞中的同源重组途径介导。Rad51表达的异常调节也可能在肿瘤细胞间的DNA损伤反应中产生异质性，这可能与癌症治疗反应有关。

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数字

图1。
图1。
MCF-7细胞暴露于0.5%O 24小时后对缺氧的转录组反应2（A）基于H/N表达比率（对数2). （插图）在两倍、四倍和六倍阈值下上调和下调基因的百分比。（B） 选择GenCompass微阵列检测到的先前被确定为受缺氧调节的基因。提供了接入号码供参考。H/N比是三个独立实验的平均值。国家发改委1,N-千年一遇下游调控基因1。（C） 所选DNA修复基因的GenCompass H/N表达比率，列出了各自的途径。H/N比是两个实验的平均值。BER，基底切除修复；MMR，不匹配修复。ERCC1号机组切除修复交叉互补组1；4月2日无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子2；PMS2型，减数分裂后分离增加2；RAD51系列，RAD51同源。
图2。
图2。
细胞系中Rad51蛋白水平降低，以应对缺氧或铁2+螯合剂DFX，以及在DFX存在下测定Rad51蛋白的稳定性。（A） Western blot分析检测MCF-7细胞在常氧（N道）、低氧（0.5或0.01%氧）和缺氧（0.5或0.01%氧）条件下HR相关蛋白Rad51的表达2)（通道H）或DFX（250μM）。显示了细胞在每种条件下保持的时间（24或48小时）。HIF-1α和谷氨酸1的表达用于比较，以验证处理细胞中存在生理相关的缺氧水平。请注意，谷氨酸1表现为我们的抗体检测到的几种亚型。Tubulin表达也用于确认相等的样本加载。（B） 正常氧或缺氧暴露48小时后A549、HeLa、SW480和A431细胞中Rad51蛋白表达的Western blot分析（0.01%O2). Tubulin的表达是为了确认HeLa和SW480细胞的样品负载相等，而β-actin被用作A549和A431细胞的负载控制。（C） 缺氧48小时后Rad51蛋白水平的平均降低（0.01%O2)，由重复（RKO、A431、SW480和PC3细胞）或三次（MCF-7、A549和HeLa细胞）缺氧实验产生的Western blot的密度测定分析确定。显示了每个细胞系的起源组织。减少量表示为H/N比值，该比值标准化为β-肌动蛋白和微管蛋白的表达，并给出了每个比值的标准误差。（D） 为了评估Rad51蛋白的稳定性，MCF-7细胞要么暴露于DFX（250μM），要么未经处理24小时，然后与CHX（10μg/ml）混合以阻止新的蛋白合成。（上面板）在添加CHX后的指定时间采集细胞，并通过Western blotting测定Rad51蛋白的表达。HIF-1α的表达证实了化学缺氧的诱导和新蛋白合成的成功取消。此外，微管蛋白水平保持不变，并作为标准来确认细胞蛋白样品的等负荷。（下面板）在暴露于DFX或未经处理的细胞中加入CHX后每个时间点的Rad51蛋白表达分析，如面板C图例中所述进行量化。每个数据点是在指定时间DFX处理或未处理细胞中剩余Rad51蛋白的百分比（归一化为微管蛋白水平后）。
图3。
图3。
转录抑制RAD51系列基因缺氧。（A） 对暴露于常氧（泳道N）、缺氧（0.01%O）后从MCF-7细胞中提取的总RNA进行Northern印迹分析2)（通道H）或DFX（250μM）。给出了细胞在每种条件下保持的时间（24或48小时）。血管内皮生长因子显示表达以进行比较，以验证处理后的细胞中存在与生理相关的缺氧水平，并显示28S rRNA的表达以确认相等的样本负荷。（B） Northern印迹分析RAD51系列缺氧24或48小时后A549、SiHa和RKO细胞的mRNA表达（0.01%2).血管内皮生长因子为了进行比较，显示了表达，以验证处理后的细胞中存在与生理相关的缺氧水平。28S rRNA（MCF-7、SiHa和RKO细胞）和β-肌动蛋白mRNA（A549细胞）用于确认相等的样本负荷。（C） 评估RAD51系列mRNA，MCF-7细胞未经处理或暴露于DFX（250μM）24小时，然后与ActD（5μg/ml）共培养以阻断转录。在添加ActD后的指定时间采集细胞，并且RAD51系列用Northern印迹法测定mRNA表达。的表达式血管内皮生长因子证实了化学缺氧的诱导和转录的成功取消。此外，28S rRNA水平保持不变，并用作确认相等样品装载量的标准。（D） 分析RAD51系列通过Northern印迹的磷光成像仪分析确定，在加入ActD后的每个时间点，暴露于DFX或未经处理的细胞中的mRNA表达。值是RAD51系列每个时间点DFX处理或未处理细胞中残留的mRNA，误差条基于重复实验计算的标准误差。（E） 5′侧翼区域示意图RAD51系列基因，描述用于荧光素酶报告基因分析的启动子片段（pGL3-Rad51p）。核心启动子区域的大致位置如真核启动子数据库（EPD）中所述，并由使用Genomatix启动子识别算法PromoterInspector进行的电子分析确定，以供参考。外显子2上方的弯曲箭头表示ATG翻译起始密码子。（F） 确定缺氧对RAD51系列基因启动子活性，即pGL3-Rad51p荧光素酶（萤火虫）报告质粒在常氧或缺氧暴露前4 h瞬时转染到RKO细胞中（48 h），然后立即测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶值标准化为雷尼利亚共转染pRL-SV40控制载体的荧光素酶活性和误差条基于重复实验计算的标准误差。荧光素酶报告质粒5X-HRE的活性显示为对照，以证实生理相关的缺氧水平，该质粒包含与人巨细胞病毒最小启动子串联连接的五个HRE。无启动子荧光素酶报告基因构建物pGL3-Basic的活性也显示为对照。
图4。
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缺氧后Rad51表达持续下调。（A） Western blot分析测定缺氧培养48 h（0.01%O2)（通道H），然后再进行复氧（R），如所示时间线所示。在缺氧后24小时间隔（通道R）采集样本，72、96和120小时的时间点分别代表复氧后24、48和72小时。作为对照，显示Rad51水平在常氧条件下在同一时间段内不会发生变化，显示了每个时间点（通道N）在恒氧条件下平行生长的细胞中的Rad51蛋白表达。HIF-1α和谷氨酰胺1的表达进行比较，以验证在处理细胞中观察到缺氧和复氧的生理相关状态。Tubulin表达也用于确认相等的样本加载。（B） 进行Northern blot分析以确定RAD51系列MCF-7细胞中的mRNA在相同的时间进程和面板A所述的相同条件下。如所示时间线所示，RAD51系列在缺氧24小时和48小时（通道h）评估mRNA表达。此外，还对缺氧后24小时（R道）的RNA样本进行了分析，72小时和96小时的时间点分别代表24小时和48小时的复氧周期。作为控件显示RAD51系列在同一时期内，在常压下，表达没有变化，RAD51系列在每个时间点（车道N）显示平行生长的正常氧细胞中的mRNA表达。血管内皮生长因子为了进行比较，显示了表达，以验证在处理过的细胞中获得了缺氧和复氧的生理相关状态。28S rRNA的表达也用于确认相等的样本装载量。
图5：。
图5：。
Rad51表达减少与细胞周期状况无关。（A） 定量评估暴露于缺氧（0.01%O2)或常压48小时。根据三次缺氧实验，使用流式细胞仪分析PI染色细胞和直方图分析软件，将计算出的比例表示为百分比。（B） G中细胞百分比的折叠变化1缺氧时相和Rad51蛋白水平与正常氧相比，分别根据面板A和图2C计算。（C） 半定量RT-PCR分析RAD51系列分离G中mRNA的表达1-正常和缺氧细胞的S期细胞群。通过使用重要的荧光色素Hoechst 33342对细胞进行DNA染色，然后进行流式细胞仪分析和细胞分选，获得等量的细胞周期特异性群体。还显示了并行处理的未分类单元格，以供参考（通道1和2）。血管内皮生长因子显示表达以进行比较，以验证正常和缺氧细胞群中缺氧的生理相关状态，以及β-肌动蛋白以确认相等的样品负载。（D） A549细胞暴露于常氧或缺氧48小时，以及A549细胞在缺氧后立即复氧指定时间的细胞周期曲线，如基于DNA含量PI染色的直方图所示。G的近似范围1-、S-和G2/M期人群仅供参考。（插图）相应时间点A549细胞中Rad51蛋白的表达。（E） 通过BrdU掺入评估正常氧A549细胞或A549细胞在指定时间复氧后的S期增殖。虚线表示阳性BrdU掺入的阈值，基于在每个时间点未经BrdU孵育的平行分析细胞。每个时间点细胞周期曲线的定量评估显示在每个面板中，并按照面板A图例中的描述进行计算。括号中给出了包含BrdU的每个样本中总细胞的百分比。
图6。
图6。
Rad51表达减少与HIF表达无关。（A） Western blot分析用于测定表达野生型（+VHL）或突变型（−VHL）VHL基因的对数期786-0细胞中Rad51蛋白的表达。显示VHL和谷氨酸1的表达以进行比较，以验证这些细胞的状态。Tubulin表达也用于确认相等的样本加载。（B） 暴露于缺氧后表达野生型或突变VHL的786-0细胞中Rad51蛋白表达的蛋白质印迹分析（0.01%O2)（C）转染HIF-1α表达载体pCEP4-HIF-1α48 h后，Western blot分析HeLa细胞中Rad51和HIF-1β的表达水平。
图7。
图7。
缺氧和缺氧后细胞HR降低。（A） 用于评估HR的穿梭载体质粒和供体DNA片段示意图。质粒pSupFG1/G144C包含一个抑制FG1在144位发生失活G:C-C:G点突变的基因。供体是一个含有部分野生型的同源DNA片段supFG1（支持FG1）基因。缩写：amp第页氨苄西林耐药基因；WT，野生型。（B） 与穿梭载体和供体片段共转染的MCF-7细胞中的重组频率，然后在单独的常氧条件下（72小时）或在缺氧条件下（0.01%O2)48小时后立即复氧，24小时常氧（缺氧+缺氧后）。括号中给出了每个样本中的蓝色菌落总数/菌落总数。误差线基于重复实验计算的标准误差。（C） 与穿梭载体和供体片段共同转染的MCF-7细胞在常氧或缺氧（0.01%O2)（缺氧后）。
图8。
图8。
宫颈癌和前列腺癌异种移植物中缺氧标记物染色和Rad51表达之间的反向关联。所示为用低氧标记物EF5（红色）和Rad51表达（绿色）对来自Me180宫颈癌细胞（A）、PC3前列腺癌细胞（B）和SiHa6宫颈癌细胞的肿瘤异种移植物进行染色的免疫荧光分析。单独的EF5、Rad51和DAPI染色（蓝色）以及Rad51-EF5合并染色（黄色）如面板A所示。面板A中的箭头表示在强EF5染色区域内Rad51表达显著降低。
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