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。2004年9月；24(18):8055-68.
doi:10.1128/MCB.24.18.8055-8068.2004。

后遗体1/p62是一种参与泛素蛋白酶体降解的多泛素链结合蛋白

拉马尔·塞贝纳 1, 杰加纳森·拉梅什·巴布, 谢吉亚·吉萨, 王兴（Hing C Wong）, 拉玛·克里希纳, 玛丽·沃滕
附属机构

Sequestome 1/p62是一种参与泛素-蛋白酶体降解的多泛素链结合蛋白

拉马尔·塞贝纳等。 分子细胞生物学。 2004年9月。

摘要

在此，我们证明了固位体1/p62的泛素相关（UBA）结构域对结合K63多泛素化底物表现出偏好。此外，p62的UBA结构域对于聚集隔离和细胞存活是必要的。然而，蛋白酶体功能的抑制降低了聚集细胞的存活率。UBA结构域的突变分析表明，螺旋2中保守的疏水补丁MGF和保守的亮氨酸对于结合多泛素化蛋白质和形成螯合聚集物是必要的。我们报道了p62通过下拉分析、共免疫沉淀和共定位与蛋白酶体相互作用。p62水平的耗尽会抑制泛素-蛋白酶体介导的降解和泛素化蛋白的积累。总之，我们的结果支持这样的假设，即p62可能是一个关键的泛素链靶向因子，可以穿梭底物进行蛋白酶体降解。

PubMed免责声明

数字

图1。
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UBA结构域非共价结合多泛素，是聚集形成所必需的。（A） 采用的p62结构是myc标记的野生型（WT）p62；全长p62（氨基酸1至440）；p62ΔN项，缺失氨基酸1-229的构建体；和p62ΔUBA，一种缺失UBA结构域的结构体（氨基酸386到440）。（B） myc标记全长p62构造或myc公司-缺失UBA结构域的标记构建（p62ΔUBA）与HA标记泛素（HA-Ub）一起转染到HEK细胞。在PNAS缓冲液（缺乏SDS）或SDS裂解缓冲液（SDS）中进行裂解和免疫沉淀（IP），然后用SDS-PAGE和Western blotting（WB）检测HA标记的泛素。（C） 所示为野生型myc-p62表达（顶部）、myc-p62-ΔUBA-表达（中部）和myc-p62/ΔN-末端表达（底部）HEK细胞在含有（+）或不含（−）蛋白酶体抑制剂ALLN（50μM）的情况下24小时外源性myc-p六十二（红色）和HA-双奎因（绿色）免疫荧光染色的激光扫描共聚焦显微镜图像。用兔抗myc IgG或鼠抗HA IgG孵育细胞，并分别用德克萨斯州红结合抗兔抗体（红色）或俄勒冈州绿结合抗鼠抗体（绿色）标记。具有重叠免疫反应性的合并图像显示为黄色。注意，表达p62的细胞缺乏其UBA结构域（p62ΔUBA），无法形成聚集物或与泛素共定位。所有实验重复三次，结果相似。（D） 将myc标记的野生型p62、p62△UBA或p62△N-term与HA标记的泛素构建物一起转染HEK细胞（在24孔板中）。转染24 h后，用或不用ALLN（50μM）处理细胞30 h。通过添加MTS试剂2 h来评估细胞存活率。所示值为四个不同实验平均值的平均值±标准误差。对照组和p62ΔUBA组之间的存活率显著降低(P（P）<0.001）和野生型p62和p62ΔN项之间(P（P）< 0.001).
图1。
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UBA结构域非共价结合多泛素，是聚集形成所必需的。（A） 所使用的p62构建体是myc标记的野生型（WT）p62；全长p62（氨基酸1至440）；p62ΔN项，缺失氨基酸1至229的结构；和p62ΔUBA，一种缺失UBA结构域的结构体（氨基酸386到440）。（B） myc标记全长p62构造或myc公司-缺失UBA结构域的标记构建（p62ΔUBA）与HA标记泛素（HA-Ub）一起转染到HEK细胞。在PNAS缓冲液（缺乏SDS）或SDS裂解缓冲液（SDS）中进行裂解和免疫沉淀（IP），然后用SDS-PAGE和Western blotting（WB）检测HA标记的泛素。（C） 所示为野生型myc-p62表达（顶部）、myc-p62-ΔUBA-表达（中部）和myc-p62/ΔN-末端表达（底部）HEK细胞在含有（+）或不含（−）蛋白酶体抑制剂ALLN（50μM）的情况下24小时外源性myc-p六十二（红色）和HA-双奎因（绿色）免疫荧光染色的激光扫描共聚焦显微镜图像。用兔抗myc IgG或鼠抗HA IgG孵育细胞，并分别用德克萨斯州红结合抗兔抗体（红色）或俄勒冈州绿结合抗鼠抗体（绿色）标记。免疫反应重叠的合并图像显示为黄色。注意，表达p62的细胞缺乏其UBA结构域（p62ΔUBA），无法形成聚集物或与泛素共定位。所有实验重复三次，结果相似。（D） 将myc标记的野生型p62、p62△UBA或p62△N-term与HA标记的泛素构建物一起转染HEK细胞（在24孔板中）。转染24 h后，用或不用ALLN（50μM）处理细胞30 h。通过添加MTS试剂2 h来评估细胞存活率。所示值为四个不同实验平均值的平均值±标准误差。对照组和p62ΔUBA组之间的存活率显著降低(P（P）<0.001）和野生型p62和p62ΔN项之间(P（P）< 0.001).
图2。
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UBA结构域结合K63连接的多泛素化底物。（A） 用HA标记的野生型泛素（HA-Ub）或泛素的K29R、K48R或K63R点突变体转染HEK细胞（左），或用HA标记的野生型泛素或泛素的K63R、K29,48R或K29,48,63R突变体转染HEK细胞（右）。在下拉分析中，细胞裂解液的等蛋白浓度与p62的UBA结构域相互作用。Western blot分析多泛素链与HA抗体的结合，检测泛素（WB:HA）。通过用HA标签抗体印迹转染细胞裂解液（40μg）的等分样品，验证泛素结构的表达。（B） 用GFP-p62转染HEK细胞，然后在固定前用（+）或不用（−）ALLN处理18 h。用TRAF6抗体对细胞进行染色，以德克萨斯红作为二级抗体。通过共焦显微镜测定TRAF6和p62的共定位。（C） 用增加剂量（0、50、75、150和300μM）的对照或TRAF6抑制肽预处理HEK细胞5小时，然后用IL-1（10ng/ml）处理15分钟。制备裂解物（200μg），并将其包含在GST-p62 UBA下拉中，然后用SDS-PAGE和抗泛素抗体进行免疫印迹。同时，用TRAF6抗体对裂解产物（750μg）进行免疫沉淀（IP），并对p62进行印迹（WB）。如图所示，用p62和TRAF6抗体印迹裂解液（40μg）。（D） 用GFP-p62转染HEK细胞，然后用TRAF6抑制肽（150μM）处理2 h，然后再添加ALLN 12 h，然后固定并用共焦显微镜观察。所有实验重复三次，结果相似。
图2。
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UBA结构域结合K63连接的多泛素化底物。（A） HEK细胞转染HA标记的野生型泛素（HA-Ub）或K29R、K48R或K63R泛素点突变体（左），或HA标记的泛素野生型或K63R、K29,48R或K29,48,63R泛肽突变体（右）。在下拉分析中，细胞裂解液的等蛋白浓度与p62的UBA结构域相互作用。多泛素链的结合通过HA抗体的蛋白质印迹分析来检测泛素（WB:HA）。通过用HA标签抗体印迹转染细胞裂解液（40μg）的等分样品，验证泛素结构的表达。（B） 用GFP-p62转染HEK细胞，然后在固定前用（+）或不用（−）ALLN处理18 h。用TRAF6抗体对细胞进行染色，以德克萨斯红作为二级抗体。通过共焦显微镜测定TRAF6和p62的共定位。（C） 用递增剂量（0、50、75、150和300μM）的对照肽或TRAF6抑制肽预处理HEK细胞5小时，然后用IL-1（10 ng/ml）处理15分钟。制备裂解物（200μg），并将其纳入GST-p62 UBA下拉物中，然后进行SDS-PAGE和抗泛素抗体免疫印迹。同时，用TRAF6抗体对裂解产物（750μg）进行免疫沉淀（IP），并对p62进行印迹（WB）。如图所示，用p62和TRAF6抗体印迹裂解液（40μg）。（D） 用GFP-p62转染HEK细胞，然后用TRAF6抑制肽（150μM）处理2 h，然后再添加ALLN 12 h，然后固定并用共焦显微镜观察。所有实验重复三次，结果相似。
图2。
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UBA结构域结合K63连接的多泛素化底物。（A） HEK细胞转染HA标记的野生型泛素（HA-Ub）或K29R、K48R或K63R泛素点突变体（左），或HA标记的泛素野生型或K63R、K29,48R或K29,48,63R泛肽突变体（右）。在下拉分析中，细胞裂解液的等蛋白浓度与p62的UBA结构域相互作用。Western blot分析多泛素链与HA抗体的结合，检测泛素（WB:HA）。通过用HA标签抗体印迹转染细胞裂解液（40μg）的等分样品，验证泛素结构的表达。（B） 用GFP-p62转染HEK细胞，然后在固定前用（+）或不用（−）ALLN处理18 h。用TRAF6抗体对细胞进行染色，以德克萨斯红作为二级抗体。通过共聚焦显微镜测定TRAF6和p62的共定位。（C） 用递增剂量（0、50、75、150和300μM）的对照肽或TRAF6抑制肽预处理HEK细胞5小时，然后用IL-1（10 ng/ml）处理15分钟。制备裂解物（200μg），并将其纳入GST-p62 UBA下拉物中，然后进行SDS-PAGE和抗泛素抗体免疫印迹。同时，用TRAF6抗体对裂解产物（750μg）进行免疫沉淀（IP），并对p62进行印迹（WB）。如图所示，用p62和TRAF6抗体印迹裂解液（40μg）。（D） 用GFP-p62转染HEK细胞，然后用TRAF6抑制肽（150μM）处理2 h，然后再添加ALLN 12 h，然后固定并用共焦显微镜观察。所有实验重复三次，结果相似。
图3。
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p62-聚泛素相互作用的关键决定因素。（A） p62的UBA结构域与包含UBA的蛋白质hHR23A UBA1、hHR23A-UBA2和Ddi1的序列比对，表明保守残基和α-螺旋形成。箭头指示突变的残基用于分析，以及它们在p62 UBA结构域三维模型上的位置。（B） UBA肽的重叠圆二色谱。（C） 用HA标记的野生型泛素（WT-Ub）转染HEK细胞或保留未转染的细胞作为对照。使用p62的GST-UBA结构域及其突变体UBA1、UBA2、UBA3、UBA4和UBA5进行下拉分析。在下拉分析中，裂解物（500μg）与5μg GST-UBA相互作用。通过免疫印迹（WB）和泛素抗体分析多泛素链与每个UBA结构的相互作用。研究结果重复了三次，结果相似。为了在下拉测定中验证等量的GST-UBA，用GST抗体探测印迹（~32kDa）。用HA抗体免疫印迹法验证HA标记泛素的表达。
图4。
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UBA-多泛素相互作用是聚集物形成所必需的。用HA标记的泛素（HA-Ub）与myc标记的p62表达结构的全长和UBA突变体共同转染HEK细胞，p62表达构建经（+）或不经（-）蛋白酶体抑制剂ALLN（50μM）处理24 h，然后用HA和UBA抗体标记myc公司。显示了代表性单元格的图像。抗myc标记（红色）检测野生型（WT）myc-p62及其UBA域突变体。抗-HA标记（绿色）检测泛素。合并后的图像显示单个染色模式之间的重叠为黄色。这些发现是两个独立实验的代表。
图5：。
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p62与蛋白酶体相互作用。（A） myc标记的构建物野生型（WT）p62、p62ΔUBA和p62△N-term在HEK细胞中表达，并按照材料和方法中的描述制备裂解物。将等量的GST-S5a琼脂糖添加到每个样品的500μg裂解液中，并在30°C下培养2 h。相互作用后，清洗珠子，并通过SDS-PAGE和带有myc抗体的Western blotting（WB）分析与S5a结合的myc标记结构。使用如图所示的适当抗体，通过Western blot分析GST-S5a的结构表达和输入到分析中的量。所有实验都进行了三次独立的复制，结果相似。（B） p62以刺激依赖的方式与蛋白酶体相互作用。用IL-1（10 ng/ml）处理HEK细胞5 min，然后用p62抗体免疫沉淀（IP）和Rpt1免疫印迹（左）。或者，在HEK细胞中表达myc标记的p62结构体，然后用IL-1（10 ng/ml）刺激。用Rpt1抗体对裂解产物（750μg）进行免疫沉淀，用myc进行免疫印迹，以检测标记的p62结构体（右图；用星号表示）。作为对照，测定裂解液（40μg）中蛋白质的表达。（C） p62直接与蛋白酶体相互作用。固定化细菌表达的GST-p62（5μg）或GST对照与纯化的26S蛋白酶体（0至1μg）孵育。洗涤后，用免疫印迹法检测结合亚基Rpt1。（D） p62聚集体含有蛋白酶体亚单位。用GFP-p62共转染HEK细胞，用ALLN（50μM）处理18 h，然后用Rpn10/S5a、Rpt1或蛋白酶体亚单位的抗体标记，如图所示。显示了代表性单元格的图像。绿色检测GFP-p62，红色检测内源性蛋白质。合并后的图像以黄色显示各个染色模式之间的重叠。
图5：。
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p62与蛋白酶体相互作用。（A） myc标记的构建体野生型（WT）p62、p62ΔUBA和p62ΔN-项在HEK细胞中表达，并如材料和方法中所述制备裂解物。将等量的GST-S5a琼脂糖添加到每个样品的500μg裂解液中，并在30°C下培养2 h。相互作用后，清洗珠子，并通过SDS-PAGE和带有myc抗体的Western blotting（WB）分析与S5a结合的myc标记结构。使用如图所示的适当抗体，通过Western blot分析GST-S5a的结构表达和输入到分析中的量。所有实验重复三次，结果相似。（B） p62以刺激依赖的方式与蛋白酶体相互作用。用IL-1（10 ng/ml）处理HEK细胞5 min，然后用p62抗体免疫沉淀（IP）和Rpt1免疫印迹（左）。或者，在HEK细胞中表达myc标记的p62结构体，然后用IL-1（10 ng/ml）刺激。用Rpt1抗体对裂解产物（750μg）进行免疫沉淀，用myc进行免疫印迹，以检测标记的p62结构体（右图；用星号表示）。作为对照，测定裂解液（40μg）中蛋白质的表达。（C） p62直接与蛋白酶体相互作用。用纯化的26S蛋白酶体（0至1μg）培养固定化细菌表达的GST-p62（5μg）或GST对照。洗涤后，用免疫印迹法检测结合亚基Rpt1。（D） p62聚集体含有蛋白酶体亚单位。用GFP-p62共转染HEK细胞，用ALLN（50μM）处理18 h，然后用Rpn10/S5a、Rpt1或蛋白酶体亚单位的抗体标记，如图所示。显示了代表性单元格的图像。绿色检测GFP-p62，红色检测内源性蛋白质。合并后的图像以黄色显示各个染色模式之间的重叠。
图6。
图6。
p62参与多泛素化蛋白的泛素蛋白酶体降解。（A） 无论是否用全长反义p62（ASp62）构建物转染HEK细胞。用p62抗体免疫印迹裂解物（40μg）检测内源性p62水平。（B） 对照或反义p62转染的HEK细胞用20 mg环己酰亚胺/ml处理，如图所示。用SDS-PAGE和抗泛素抗体免疫印迹（WB）分离全细胞裂解物（40μg）。（C） 如图所示，测定并绘制了在对照和反义p62裂解物中存在的五种显著的多泛素化蛋白的相对表达。实验重复两次，结果相似。
图6。
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p62参与多泛素化蛋白的泛素蛋白酶体降解。（A） 无论是否用全长反义p62（ASp62）构建物转染HEK细胞。用p62抗体免疫印迹裂解物（40μg）检测内源性p62水平。（B） 对照或反义p62转染的HEK细胞用20 mg环己酰亚胺/ml处理，如图所示。用SDS-PAGE和抗泛素抗体免疫印迹（WB）分离全细胞裂解物（40μg）。（C） 如图所示，测定并绘制了在对照和反义p62裂解物中存在的五种显著的多泛素化蛋白的相对表达。实验重复了两次，结果相似。
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