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.2004年9月；24(17):7559-66.
doi:10.1128/MCB.24.17.7559-7566.2004。

转录因子snail和slug的异常表达改变了对基因毒性应激的反应

加吉田正弘 1, Karissa N McClinic公司, 保罗·A·韦德
附属公司

转录因子snail和slug的异常表达改变了对基因毒性应激的反应

卡吉塔（Masahiro Kajita）等。 分子细胞生物学. 2004年9月.

摘要

蜗牛和蛞蝓是后生动物发育过程中参与胚胎模式形成的密切相关的转录阻遏物。在人类癌症中，蜗牛和/或鼻涕虫的异常表达与侵袭性生长潜能相关，这一特性主要归因于它们能够直接抑制与细胞间粘附有关的基因的转录，这些基因的产物包括E-cadherin、occludin和claudins。为了研究蜗牛或鼻涕虫异常表达介导的上皮细胞命运改变的分子机制，我们分析了这些因子在人类癌细胞中外源性表达的后果。蜗牛或鼻涕虫的异常表达导致细胞形态改变，失去正常的细胞-细胞接触，获得侵袭性生长特性。蜗牛或鼻涕虫的表达也促进了对DNA损伤引起的程序性细胞死亡的抵抗。详细的分子分析揭示了多种因子的直接转录抑制，这些因子在程序性细胞死亡中有着广泛的作用。RNA干扰耗尽内源性蜗牛导致对DNA损伤的敏感性增加，同时作为蜗牛靶点的促凋亡因子表达增加。因此，蜗牛或Slug的异常表达可能通过增加对程序性细胞死亡的抵抗力来促进肿瘤发生。

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图1。
图1。
蜗牛或鼻涕虫的表达导致上皮细胞的表型改变。（a至i）MCF7细胞感染模拟（a、b和c）、蜗牛（d、e和f）或鼻涕虫（g、h和i）腺病毒。可视化绿色荧光蛋白（a、d和g）和闭塞素（b、e和h）的细胞分布。合并的图像显示在面板c、f和i中。（j）通过蜗牛或蜗牛（使用HA表位）、肌动蛋白、E-cadherin和闭塞素的免疫印迹分析感染蜗牛、Slug或模拟腺病毒的MCF7细胞。通过密度测定法定量E-cadherin丰度显示，蜗牛表达导致E-cadherin蛋白减少35%（2天）和53%（4天），而Slug表达导致E-cadherin蛋白减少63%（2天”）和60%（4天”）。
图2。
图2。
蜗牛或鼻涕虫的表达会增加入侵并保护细胞免受程序性死亡。（a） 蜗牛、鼻涕虫或模拟腺病毒感染的MCF7细胞接种在Matrigel入侵室中。未感染细胞作为对照。对侵袭细胞进行染色和计数。数据表示平均值±标准偏差。✽,P（P）<0.05（由学生确定t吨测试）。（b） MCF7感染蜗牛、鼻涕虫或模拟腺病毒后，用ADR处理细胞，用TUNEL法检测基因组DNA断裂。对于每个细胞系，在没有ADR治疗的情况下，将任意值1分配给模拟病毒感染细胞。给定细胞系的所有其他值都是相对于该对照组表达的。数据表示平均值±标准偏差。✽,P（P）<0.05（由学生确定t吨测试）。
图3。
图3。
蜗牛或鼻涕虫的表达通过转录抑制多个靶点来改变凋亡反应。（a） 从感染蜗牛、鼻涕虫或模拟腺病毒的MCF7中提取总RNA，并用ADR或载体治疗。使用定量RT-PCR测定指示转录物的稳定水平。所有转录水平均归一化为肌动蛋白。所有数据代表三个独立实验的平均值±标准偏差。✽,P（P）<0.05（由学生确定t吨测试）。（b） 蜗牛和Slug的同时表达不会对p53丰度产生加性效应。MCF7细胞被模拟腺病毒、蜗牛腺病毒、鼻涕腺病毒或蜗牛+鼻涕腺病毒感染。48小时后，收集细胞并通过免疫印迹分析蛋白裂解产物。（c） 用ADR处理蜗牛、鼻涕虫或模拟感染的MCF7，孵育指定时间，并用指定抗体进行免疫印迹分析。（d和e）如图a所示，对所示基因座的转录水平进行分析。
图4。
图4。
响应基因的蜗牛和鼻涕虫定位。对感染蜗牛、鼻涕虫或模拟腺病毒的MCF7细胞进行ChIP分析。P1至P9表示PCR引物集，用于从指定的位点扩增基因组DNA。引物集P2、P4、P6、P7、P8和P9扩增包含蜗牛或鼻涕虫结合位点的片段，而引物集P1、P3和P5扩增缺少蜗牛或鼻涕虫位点的附近区域。使用指定的引物对扩增与蜗牛和对照抗体共沉淀的DNA。
图5：。
图5：。
使用RNAi耗尽内源性蜗牛导致p53水平升高，并增加对凋亡刺激的敏感性。（a） 对于左面板，A375细胞感染了模拟腺病毒或shRNA-钉子腺病毒；对照细胞未受感染。从每个细胞群中制备总RNA，并使用图中所示的蜗牛、Slug和肌动蛋白引物通过RT-PCR进行分析。对于右侧面板，使用shRNA-Snail腺病毒去除蜗牛，并通过免疫印迹分析裂解产物。通过密度测定法定量p53的稳态水平显示，蜗牛耗尽后，p53水平增加了1.6倍。（b和c）从感染shRNA-钉子或对照腺病毒的A375细胞中提取总RNA，并通过RT-PCR进行分析，如图a所示。转录水平归一化为肌动蛋白。所有数据代表三个独立实验的平均值±标准偏差。✽,P（P）<0.05（由学生确定t吨测试）。
图6。
图6。
蜗牛的敲除导致对ADR治疗诱导的程序性细胞死亡的敏感性增加。（a） 用ADR处理感染shRNA-钉子或模拟腺病毒的A375细胞，并用免疫荧光检测TUNEL阳性细胞。（b） 面板a中描述的TUNEL分析的定量。所有数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。✽,P（P）<0.05（由学生确定t吨测试）。
图7。
图7。
蜗牛或鼻涕虫对上皮-间充质转化的调节。该模型描述了蜗牛和/或鼻涕虫调节的上皮细胞向间充质细胞转变的各个方面。文中讨论了模型的细节。
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