The SARS coronavirus nucleocapsid protein induces actin reorganization and apoptosis in COS-1 cells in the absence of growth factors

doi:10.1042/BJ20040984

。2004年10月1日；383（第1部分）：13-8。

doi:10.1042/BJ20040984。

SARS冠状病毒核衣壳蛋白在缺乏生长因子的情况下诱导COS-1细胞肌动蛋白重组和凋亡

米兰苏尔吉特¹, 刘伯平, 巴基斯坦的杰米尔, 文森特·T·K·周, 苏尼尔·卡拉尔

附属机构

PMID： 15294014
预防性维修识别码：项目经理1134038
内政部： 10.1042/BJ20040984

SARS冠状病毒核衣壳蛋白在缺乏生长因子的情况下诱导COS-1细胞肌动蛋白重组和凋亡

米兰苏尔吉特等。生物化学杂志。 2004。

。2004年10月1日；383（第1部分）：13-8。

doi:10.1042/BJ20040984。

作者

米兰苏尔吉特¹, 刘伯平, 巴基斯坦的杰米尔, 周文祥, 苏尼尔·卡拉尔

附属

¹印度新德里Aruna Asaf Ali路国际基因工程和生物技术中心病毒学小组，邮编110067。

PMID： 15294014
预防性维修识别码：项目经理1134038
内政部： 10.1042/BJ20040984

摘要

2003年3月，从表现出非典型肺炎的患者中分离出一种新型冠状病毒，随后被证明是该疾病的病原体，现在被称为SARS（严重急性呼吸综合征）。SARS-CoV（SARS冠状病毒）的完整基因组已经测序。SARS-CoV核衣壳蛋白（SARS-CoVN）与冠状病毒家族的其他成员几乎没有同源性。本文研究表明，SARS-CoV N能够通过下调ERK（胞外信号调节激酶）、上调JNK（c-Jun N末端激酶）和p38 MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路，并影响其下游效应器，从而在无生长因子的情况下诱导COS-1猴肾细胞凋亡。SARS-CoV N表达也下调磷酸化Akt和Bcl-2水平，并激活caspases 3和7。然而，凋亡独立于p53和Fas信号通路。此外，在缺乏生长因子的细胞中，p38 MAPK通路的激活可诱导肌动蛋白重组。在细胞骨架水平，SARS-CoV N下调FAK（黏着斑激酶）活性，也下调纤维连接蛋白表达。这是首次报道SARS-CoV的N蛋白在应激条件下诱导哺乳动物细胞凋亡和肌动蛋白重组的能力。

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数字

**图1。SARS冠状病毒N诱导细胞死亡**
(A类)通过免疫沉淀模拟转染（C）或pcDNA3.1分析N蛋白的表达*myc公司*-标记的N-（myc-N）或pSGI-HA-taged N-（HA-N）转染的细胞裂解物带有相应的抗体。车道2和4显示N表示，而车道1和3是各自的控制。(B类)TUNEL分析结果。通道1和通道2分别显示存在血清（Ser）的模拟（C）或N转染（N）细胞，而通道3和通道4显示不存在血清的相同细胞。TUNEL阳性细胞从三组实验中的每一组共500个细胞中进行评分。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。这个*P（P）*车道1和2的值为0.17，车道3和4的值为0.02。不含血清的TUNEL阳性细胞约占总细胞数的30%。蛋白质。(C类)在显微镜下观察到的TUNEL阳性细胞的代表性视野。

**图2。N下调纤维连接蛋白表达**
(A类)Mock转染（C）或N转染（N）细胞保持在有（Ser+）或无（Ser-）血清的状态。对于细胞外纤维连接蛋白水平（上面板），使用相应抗体免疫沉淀生长介质。对于细胞内纤连蛋白水平，用布雷费尔丁A（10μg/ml）处理细胞2小时，在RIPA缓冲液中裂解，使用抗纤连蛋白抗体进行免疫沉淀，通过SDS/6%PAGE进行解析并进行免疫印迹。参考同一凝胶中的非特异性条带（calnexin）（对于细胞外纤连蛋白或对于细胞内纤连蛋白的calnexin水平）对值进行标准化。(B类)在上述类似条件下生长的细胞在SDS缓冲液中溶解，用SDS/7%PAGE进行解析，并用抗整合素α进行免疫印迹_V（V）)或抗calnexin抗体（负荷控制）。(C类)p-FAK（Tyr）水平³⁹⁷). 下凝胶显示calnexin水平作为负荷控制。N（1.5）和N（3）分别表示转染1.5μg和3μg DNA的样品。用3μg空载体DNA转染模拟样品。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。(D类)分别在有血清（1、2和3道）或无血清（4和5道）的情况下，用抗Myc抗体进行免疫沉淀，以不同浓度的DNA评估N的表达。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。

**图3。N蛋白表达调节细胞MAPK活性**
(A类)Mock转染或Myc–N克隆转染细胞在血清（Ser+）中保持48小时（1–3道）或在血清中饥饿24小时（Ser−，4–6道）；用SDS裂解缓冲液采集，用SDS/12%聚丙烯酰胺凝胶电泳解析，并用相应抗体进行免疫印迹。图中显示了p-ERK和总ERK的水平。直方图显示了平均值±S。三组独立实验的E.M。(B类)p-JNK、p-Jun和总c-Jun水平。Calnexin用于确保载荷相等。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。黑色条代表p-JNK，深灰色条代表p-c-Jun，浅灰色条代表c-Jun(C类)p-p38 MAPK、p-MAPKAPK2（MAPK-activated protein kinase 2）和p-HSP27水平。p38 MAPK总水平作为p-p38 MAPK的负荷控制。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。黑色条表示p-p38 MAPK，深灰色条表示p-MAPKAPK2，浅灰色条表示p-HSP27。

**图4。SARS冠状病毒N蛋白诱导肌动蛋白重组**
用罗丹明结合的指骨肽和HA标记的N进行免疫荧光研究(A类)肌动蛋白在血清中的分布。黄色箭头表示N转染细胞，绿色箭头表示未转染细胞。(B类)用FITC缀合的抗小鼠抗体染色的N表达的相同区域（合并图像）。(C类)肌动蛋白在无血清情况下的分布。箭头如中所示(A类). (E类)细胞松弛素D（5 nM）存在时肌动蛋白的再分配。(**G公司**)SB203580（10μg/ml）的影响。(D类,如果和**H（H）**)将FITC-染色图像叠加在罗丹明染色图像上，分别显示在无血清、细胞松弛素D或SB203580的情况下N的表达。

**图5。N表达下调促生存因子并在缺乏生长因子的情况下诱导凋亡**
(A类)p-Akt（Thr）水平³⁰⁸)存在（Ser+）和不存在（Ser-）血清。下面的凝胶显示了相同条件下的总Akt水平。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。(B类)分别在有血清（Ser+）或无血清（Ser-）的情况下，从模拟（C）或N转染（N）细胞裂解液中免疫沉淀Bcl-2，并通过Western blotting检测。calnexin水平显示为底部凝胶中的负载控制。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。(C类)N-表达细胞（通道4）中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和7的激活。抗（caspase 3）抗体检测前体和裂解产物。(D类)抗（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7）抗体仅对裂解产物具有特异性。(E类)在PI3K（110，第1条通道）、10μg/ml SB203580（SB，第2条通道）或100μM Z-VAD-FMK（Z，第3条通道）的p110α亚单位过表达的情况下，对血清缺乏的N表达细胞中caspase 3进行Western blot。

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